JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Optiska kvantifiering av intracellulära pH i Drosophila melanogaster Malpighian tubuli epitel med ett fluorescerande genetiskt-kodade pH indikatorn

Published: August 11, 2017
doi:
10.3791/55698
,
1Department of Physiology and Biomedical Engineering,Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Nephrology and Hypertension,Mayo Clinic College of Medicine

Summary

Cellulära ion transport kan ofta bedömas genom att övervaka intracellulära pH (pHjag). Genetiskt ger kodade pH-indikatorer (GEpHIs) optiska kvantifiering av intracellulära pH i intakta celler. Detta protokoll Detaljer kvantifiering av intracellulära pH genom cellulär ex vivo live-imaging av Malpighian tubuli av Drosophila melanogaster med pHerry, en pseudo-proportionerlig kodade genetiskt pH-indikator.

Abstract

Epitelial ion transport är avgörande för systemisk ion homeostas samt underhåll av viktiga cellulära elektrokemiska gradient. Intracellulära pH (pHjag) påverkas av många ion transportörer och därmed övervakning pHjag är ett användbart verktyg för att bedöma transportör aktivitet. Moderna genetiskt kodade pH-indikatorer-(GEpHIs) ger optiska kvantifiering av pHjag i intakta celler på cellulär och subcellulär nivå. Det här protokollet beskriver realtid kvantifiering av cellulära pHjag reglering i Malpighian tubuli (MTs) i Drosophila melanogaster genom ex vivo live-imaging av pHerry, en pseudo-proportionerlig GEpHI med ett pKen väl lämpad att spåra pH-förändringar i cytosolen. Extraherade vuxen fluga MTs består av morfologiskt och funktionellt distinkta delar av encellig skikt epitel, och kan fungera som en lättillgänglig och genetiskt lätthanterlig modell för utredning av epitelial transport. GEpHIs erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella pH-känsliga fluorescerande färgämnen och jonselektiva elektroder. GEpHIs kan märka olika cellpopulationer förutsatt lämpligt arrangören element är tillgängliga. Denna märkning är särskilt användbart i ex vivo, vivooch i situ preparat, som är till sin natur heterogen. GEpHIs möjliggöra kvantifiering av pHi i intakta vävnader över tiden utan behovet av upprepade dye behandling eller vävnad externalisering. Den främsta nackdelen med nuvarande GEpHIs är tendensen att aggregera i cytosoliskt inneslutningar som svar på vävnadsskada och konstruera över uttryck. Dessa brister, sina lösningar och de inneboende fördelarna med GEpHIs är visat i detta protokoll genom bedömning av basolateral proton (H+) transport i funktionellt distinkta huvudman och stjärnformade celler av extraherade fluga MTs. De tekniker och analys som beskrivs är lätt att anpassa till en mängd olika ryggradsdjur och ryggradslösa preparat och förfining av analysen kan skalas från undervisning labs intrikata fastställandet av ion flux via specifika transportörer.

Introduction

Målet med detta protokoll är att beskriva kvantifieringen av intracellulära pH (pHi) använda en genetiskt-kodade pH-indikator (GEpHI) och visar hur denna metod kan användas för att bedöma basolateral H+ transport i en modell insekt (D. melanogaster) nedsatt struktur, den Malpighian tubuli (MT). MTs fungera som bananflugan utsöndrings organ och är funktionellt liknar den hos däggdjur nefronet i flera viktiga avseenden1. MTs arrangeras som 2 par av tubuli (främre och bakre) i bröstkorg och mage av i farten. Encelliga epitelial röret för varje MT består av metaboliskt aktiva huvudsakliga celler med distinkta apikala (luminala) och basolateral (hemocoel) polaritet samt ortodoxas stjärnformade celler. Främre MTs består av 3 morfologiskt, funktionellt, och utvecklingsmässigt distinkta segment, särskilt inledande vidgade segment, övergångsbestämmelser segment och sekretoriska viktigaste segmentet, som ansluter sig till urinledaren2. På cellulär nivå trans-epitelial ion transport till lumen åstadkoms genom en apikal plasmamembranet V-ATPas3 samt en alkali-metall/H+ -växlare och en basolateral Na+-K+-ATPas4, inåt-likriktaren K+ kanaler5, Na+-driven Cl−/HCO3− värmeväxlare (NDAE1)6och Na+-K+-2 Cl− hämmare (NKCC; Ncc69)7, medan stjärnformade celler medla Cl– och vatten transport8,9. Detta komplex men tillgänglig fysiologiska system ger utmärkta möjligheter för utredning av endogena ion transportmekanismer i kombination med olika genetiska och beteendemässiga toolsets av Drosophila.

Motivet för detta protokoll var att beskriva ett genetiskt formbart system för att studera epitelial ion transport med potential för integration från cell till beteende och export av verktyg till andra modellsystem. Uttryck för pHerry10, en GEpHI som härrör från en fusion av gröna pH-känsliga Super ekliptikan pHluorin11,12 (SEpH) och röd pH-okänsliga mCherry13, i MTs möjliggör kvantifiering av H+ transport i enstaka MT celler genom den höga K+/nigericin kalibrering teknik14. Många ion transportörer flyttar H+ medel, fungerar kvantifiering av intracellulära pHjag som en funktionell representation av ion rörelse via en mängd olika transportörer. Drosophila MT modell systemet erbjuder även kraftfulla genetiska verktyg vävnadsspecifika transgenens15 och RNA interferens (RNAi)16 uttryck, som kan kombineras med cellular imaging och hela-orgel analyser17 , 18 , 19 i tubuli-funktionen för att skapa en robust verktygslåda med vertikal integration från molekyler till beteende. Detta står i kontrast till många andra protokoll för att bedöma epitelial biologi, som historiskt sett sådana mätningar har förlitat sig på intrikata och skrämmande mikro-dissektion, sofistikerad jonselektiva elektroder20,21, och dyra pH-känsliga färgämnen22 med restriktiva lastning krav och dålig cellulära specificitet i heterogena vävnader. GEpHIs har använts i stor utsträckning mäta pHjag i en mängd cell typer23. Tidiga verk utnyttjas den inneboende pH-känsligheten av grönt fluorescerande Protein (GFP) att övervaka pHjag i odlade epitelceller24 men de senaste två decennierna har sett GEpHIs som används i nervceller25, glia26, svampar27 , och växten celler28. Kombinationen av potentialen för cellulära inriktning genetisk konstruktioner genom de GAL4/UAS uttryck system15 och den Drosophila MT fysiologiska tillgänglighet gör detta till en idealisk förberedelse för utredningar av pHjag förordning och epitelial ion transport.

pHi förordning har studerats i årtionden och är avgörande för liv. MT preparatet erbjuder en robust modell att lära fysiologi av pHi förordning men också utföra sofistikerade utredningar av pHi förordning ex vivo och in vivo. Detta protokoll beskriver kvantifiering av H+ rörelse över basolateral membranet i epitelcellerna i Drosophila MT använder NH4Cl puls syra lastning teknik21, men som den pH-indikatorn är genetiskt kodade, kan dessa metoder och deras teoretiska ram tillämpas på någon beredning mottagliga för genmodifiering och live-imaging.

Protocol

Alla steg i detta protokoll överensstämmer med riktlinjerna Mayo Clinic (Rochester, MN) användning av djur. 1. flyga djurhållning Höja flugor och uppsättning korsar enligt standard djurhållning29.Obs: Fluorescerande reporter uttryck av GAL4/UAS systemet är proportionell mot temperaturen och således uppfödning temperaturen kan justeras för att förändra uttrycket nivå. Medan hög uttrycksnivåerna ofta leda till en bättre signal-brus-förhåll…

Representative Results

Friska vävnader och korrekt identifiering av främre MTs är avgörande för framgång i detta protokoll. Under dissektion, bör man inte direkt beröring MTs och endast handtag dem genom urinledaren som gripande MTs direkt kommer att leda till brott (figur 4A– B). När MTs sopas platta in i bilden, tubuli får röras så lite som möjligt och överflödig motion undvikas eftersom detta kommer att skada encelliga epitelsk…

Discussion

Framgången för kvantifiering av pHjag i Drosophila MTs beror helt på extraherade MTs och kvaliteten på montering och dissektion (Figur A – C) hälsa. Således är beskrivs noggrann hantering av vävnad som absolut nödvändigt. Bilder nyligen målade i PLL väsentligt stöd MT montering eftersom de tenderar att vara mycket mer lim än glider som tidigare har exponerats lösning. Noggrann montering kommer också stöd i att identifiera distinkt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av NIH DK092408 och DK100227 till MFR. AJR stöddes av T32-DK007013. Författarna vill tacka Dr Julian A.T. Dow för CapaR-GAL4 och c724-GAL4 Drosophila bestånd. Vi tackar också Jacob B. Anderson för hjälp att upprätthålla experimentella flyga kors.

Materials

Poly-L-Lysine Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10x/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 uL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (6), F1237-F1244 (2010).
  2. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. P Natl Acad Sci USA. 94 (10), 5207-5212 (1997).
  3. Davies, S. A., et al. Analysis and inactivation of vha55, the gene encoding the vacuolar ATPase B-subunit in Drosophila melanogaster reveals a larval lethal phenotype. J Biol Chem. 271 (48), 30677-30684 (1996).
  4. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. P Natl Acad Sci USA. 101 (37), 13689-13693 (2004).
  5. Evans, J. M., Allan, A. K., Davies, S. A., Dow, J. A. Sulphonylurea sensitivity and enriched expression implicate inward rectifier K+ channels in Drosophila melanogaster renal function. J Exp Biol. 208 (Pt 19), 3771-3783 (2005).
  6. Sciortino, C. M., Shrode, L. D., Fletcher, B. R., Harte, P. J., Romero, M. F. Localization of endogenous and recombinant Na(+)-driven anion exchanger protein NDAE1 from Drosophila melanogaster. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (2), C449-C463 (2001).
  7. Ianowski, J. P., O’Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207 (Pt 15), 2599-2609 (2004).
  8. O’Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274 (4 Pt 2), R1039-R1049 (1998).
  9. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. P Natl Acad Sci USA. 111 (39), 14301-14306 (2014).
  10. Rossano, A. J., Kato, A., Minard, K. I., Romero, M. F., Macleod, G. T. Na+ /H+ -exchange via the Drosophila vesicular glutamate transporter (DVGLUT) mediates activity-induced acid efflux from presynaptic terminals. J Physiol. 595 (3), 805-824 (2017).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  12. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  16. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151 (2007).
  17. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  18. Hirata, T., et al. In vivo Drosophilia genetic model for calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1555-F1562 (2012).
  19. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J Vis Exp. (105), (2015).
  20. Caldwell, P. C. An investigation of the intracellular pH of crab muscle fibres by means of micro-glass and micro-tungsten electrodes. J Physiol. 126 (1), 169-180 (1954).
  21. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
  22. Rink, T. J., Tsien, R. Y., Pozzan, T. Cytoplasmic pH and free Mg2+ in lymphocytes. J Cell Biol. 95 (1), 189-196 (1982).
  23. Bizzarri, R., Serresi, M., Luin, S., Beltram, F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review. Anal Bioanal Chem. 393 (4), 1107-1122 (2009).
  24. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  25. Raimondo, J. V., Irkle, A., Wefelmeyer, W., Newey, S. E., Akerman, C. J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons. Front Mol Neurosci. 5, 68 (2012).
  26. Raimondo, J. V., et al. Tight Coupling of Astrocyte pH Dynamics to Epileptiform Activity Revealed by Genetically Encoded pH Sensors. J Neurosci. 36 (26), 7002-7013 (2016).
  27. Bagar, T., Altenbach, K., Read, N. D., Bencina, M. Live-Cell imaging and measurement of intracellular pH in filamentous fungi using a genetically encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell. 8 (5), 703-712 (2009).
  28. Gjetting, K. S., Ytting, C. K., Schulz, A., Fuglsang, A. T. Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor. J Exp Bot. 63 (8), 3207-3218 (2012).
  29. Greenspan, R. J. . Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
  30. Raimondo, J. V., et al. A genetically-encoded chloride and pH sensor for dissociating ion dynamics in the nervous system. Front Cell Neurosci. 7, 202 (2013).
  31. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
  32. Terhzaz, S., et al. Mechanism and function of Drosophila capa GPCR: a desiccation stress-responsive receptor with functional homology to human neuromedinU receptor. PloS one. 7 (1), e29897 (2012).
  33. Boyarsky, G., Ganz, M. B., Sterzel, R. B., Boron, W. F. pH regulation in single glomerular mesangial cells. I. Acid extrusion in absence and presence of HCO3. Am J Physiol. 255 (6 Pt 1), C844-C856 (1988).
  34. Chesler, M. The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol. 34 (5), 401-427 (1990).
  35. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
  36. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61 (2), 296-434 (1981).
  37. Vaughan-Jones, R. D., Wu, M. L. pH dependence of intrinsic H+ buffering power in the sheep cardiac Purkinje fibre. J Physiol. 425, 429-448 (1990).
  38. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D., Peers, C., Nye, P. C. Intracellular pH and its regulation in isolated type I carotid body cells of the neonatal rat. J Physiol. 436, 107-129 (1991).
  39. Bevensee, M. O., Schwiening, C. J., Boron, W. F. Use of BCECF and propidium iodide to assess membrane integrity of acutely isolated CA1 neurons from rat hippocampus. J Neurosci Methods. 58 (1-2), 61-75 (1995).
  40. Arosio, D., et al. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nat Methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  41. Wu, Y., Baum, M., Huang, C. L., Rodan, A. R. Two inwardly rectifying potassium channels, Irk1 and Irk2, play redundant roles in Drosophila renal tubule function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (7), R747-R756 (2015).
  42. Schulte, A., Lorenzen, I., Bottcher, M., Plieth, C. A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods. 2, 7 (2006).
  43. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  44. Johnson, D. E., et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem. 284 (31), 20499-20511 (2009).
  45. Mahon, M. J. pHluorin2: an enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Adv Biosci Biotechnol. 2 (3), 132-137 (2011).
  46. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  47. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133 (26), 10034-10037 (2011).
  48. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochimica et biophysica acta. 1850 (11), 2318-2328 (2015).
  49. Kogure, T., et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat biotechnol. 24 (5), 577-581 (2006).
  50. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. P Natl Acad Sci USA. 95 (12), 6803-6808 (1998).
  51. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  52. Stornaiuolo, M., et al. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Mol Biol Cell. 14 (3), 889-902 (2003).
  53. Makkerh, J. P., Dingwall, C., Laskey, R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol. 6 (8), 1025-1027 (1996).
  54. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  55. McGuire, R. M., Silberg, J. J., Pereira, F. A., Raphael, R. M. Selective cell-surface labeling of the molecular motor protein prestin. Biochem Biophys Res Comm. 410 (1), 134-139 (2011).

Tags

Intracellular PHDrosophila MelanogasterMalpighian Tubule EpitheliaFluorescent Genetically-encoded PH IndicatorBasolateral Proton TransportEpithelial Proton MovementPH RegulationInsect EpithelialMammalian NephronEpithelial CellsIPBSSchneider’s MediumDissectionForceps
check_url/55698?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image