फास्फोरिलेशन साइट निर्धारण के लिए ओलिगोपेप्टाइड प्रतियोगिता परख
Summary
पेप्टाइड प्रतियोगिता एशेज का व्यापक रूप से आणविक और इम्यूनोलॉजिकल प्रयोगों में उपयोग किया जाता है। यह पत्र एक इन विट्रो ऑलिगोपेप्टाइड प्रतिस्पर्धा कीजिंग परख और संबंधित सत्यापन प्रक्रियाओं के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन करता है, जो विशिष्ट फास्फोरेट्रेशन साइटों को खोजने के लिए उपयोगी हो सकता है।
Abstract
विशिष्ट साइटों पर प्रोटीन फॉस्फोरेलेशन, अन्य अणुओं के साथ इसकी रचना और संपर्क निर्धारित करता है। इस प्रकार, प्रोटीन फास्फोराइलेशन सेल के जैविक कार्यों और विशेषताओं को प्रभावित करता है। वर्तमान में, फास्फोराइलेशन साइटों की खोज के लिए सबसे सामान्य तरीका तरल क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी / एमएस) विश्लेषण, एक तेज़ और संवेदनशील तरीके से है हालांकि, फ्रैगमेंटेशन चरण के दौरान अपेक्षाकृत लैबल फॉस्फेट मोएटिज़ अक्सर फॉस्फोपेप्टाइड से जारी होते हैं, जो प्रायः झूठे नकारात्मक संकेत देते हैं। ऐसे मामलों में, साइट-निर्देशित म्यूटेंट का उपयोग करते हुए इन विट्रो किनेज परख में पारंपरिक रूप से अधिक सटीक होगा, लेकिन यह विधि श्रमसाध्य और समय-उपभोक्ता है। इसलिए, पेप्टाइड प्रतियोगिता का उपयोग कर एक वैकल्पिक तरीका लाभप्रद हो सकता है। 5 'एडेनोसिन मोनोफोस्फेट-सक्रिय प्रोटीन कीनेज (एएमपीके) की आम सहमति मान्यता वाले प्रारूप 1 की स्थापना की गई है और इसे स्थैतिक स्कैनिंग पेप्टाइड लाइब्रेरी गधे का उपयोग करके मान्य किया गया है।ए 2 इस प्रकार, एक उपन्यास सब्सट्रेट के लिए एएमपीके फास्फोराइलाशन साइट पेप्टाइड प्रतियोगिता एशेज द्वारा अनुमानित और पुष्टि की जा सकती है। इस रिपोर्ट में, हम एएमपीके-मध्यस्थता वाले परमाणु कारक इरिथोड 2-संबंधी कारक 2 (एनआरएफ 2) फास्फोराइलेशन के उदाहरण के लिए इन विट्रो ऑलिगोपेप्टाइड-प्रतिस्पर्धी किनेज परख के विस्तृत चरणों और प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। फॉस्फोरायलेशन साइट को प्रमाणित करने के लिए, हमने एक साइट-विशिष्ट उत्परिवर्ती का उपयोग करते हुए इन विट्रो किनेज परख में अनुक्रमित किया। कुल मिलाकर, पेप्टाइड प्रतियोगिता परख कई संभावित फॉस्फोराइलेशन साइटों को स्क्रीन करने और फॉस्फोरायलेशन साइट म्यूटेंट द्वारा मान्यता के लिए साइटों की पहचान करने के लिए एक विधि प्रदान करता है।
Introduction
किसी विशिष्ट अवशेष पर प्रोटीन फॉस्फोरेलेशन, सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस प्रकार, सिग्नलिंग नेटवर्क की समझ के लिए विशिष्ट फास्फोरेटेशन साइटों की पहचान की आवश्यकता होती है इसके अलावा, फास्फोराइलेशन साइट प्रोटीन फ़ंक्शन पर प्रभाव को निर्धारित करती है क्योंकि प्रोटीन के भीतर अलग-अलग डोमेन विभिन्न संरचनाओं और कार्यों के पास होते हैं। परमाणु कारक एरीथोड 2-संबंधी कारक 2 (एनआरएफ 2) की गतिविधि, एक महत्वपूर्ण एंटीऑक्सीडेंट प्रतिलेखन कारक, द्वि-दिशात्मक रूप से विभिन्न साइटों पर फॉस्फोरेलेशन के माध्यम से विनियमित होती है। हमारे अध्ययन ने किनास पर ध्यान केंद्रित किया है जो एनआरएफ 2 के फास्फोरायलेशन को उत्प्रेरित करता है। ऑक्सीडेटिव चुनौती के खिलाफ एनआरएफ 2 की तनाव प्रतिक्रिया तेजी से होती है, मुख्य रूप से सीरिन 40 में फास्फोरियम के माध्यम से होती है और प्रोटीन कीनेस सी (पीकेसी) -डी द्वारा मध्यस्थता होती है, जो एनआरएफ 2 3 , 4 को सक्रिय करती है। इसके विपरीत, फ़िन ने टायरोसिन 5 पर एनआरएफ 2 के निरोधात्मक फास्फोरायलेशन का उत्प्रेरित किया हैगतिविधि के तंग नियंत्रण के लिए 68
फास्फोरिलेशन साइटों को खोजने के लिए सबसे आम तरीका तरल क्रोमैटोग्राफी / जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी / एमएस) विश्लेषण है। रैपिड और अत्यधिक संवेदनशील फास्फोराइलेशन साइट मैपिंग डेटा इस तरह से उत्पन्न किया जा सकता है; हालांकि, इसमें कई तकनीकी सीमाएं हैं, जो अक्सर झूठे नकारात्मक संकेत उत्पन्न करती हैं। एलसी / एमएस विश्लेषण में अक्सर गरीब अनुक्रम कवरेज होता है Phosphorylation साइटों की पहचान करने के लिए, प्रोटीन की अधिकतम अमीनो एसिड कवरेज की जानकारी आवश्यक है 6 पाचन चरण के दौरान कई प्रोटीज़ के साथ ब्याज की प्रोटीलाइज़िस अनुक्रम कवरेज को सुधारने में मदद से हो सकता है। फॉस्फोरायलेशन अवशेषों की पहचान के लिए एक और बाधा फॉस्फोरिक एसिड की सहज हानि है जिसे अक्सर सेरीन और थ्रेऑनिन-फास्फोराइलेटेड पेप्टाइड्स 6 , 7 के लिए देखा जाता है । लैबिल फॉस्फेट मोएटियां अक्सर होती हैंविखंडन प्रक्रिया के दौरान फॉस्फोपेप्टाइड से जारी 7 दूसरा विकल्प जब फास्फोरिलेशन साइटों के लिए खोज पेप्टाइड माइक्रोएरे विधि का उपयोग कर रहा है। ब्याज की एक प्रोटीन से प्राप्त पेप्टाइड टुकड़े वाले माइक्रोएरे चिप का उपयोग करके किनेज लक्ष्य साइटों के लिए स्क्रीन संभव है। हालांकि, माइक्रोएरे चिप के उत्पादन और पता लगाने के लिए उपकरण की आवश्यकता के कारण, पेप्टाइड माइक्रोएरे विधि को समय लेने और महंगी माना जाता है।
इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए, एक इन विट्रो ऑलिगोपेप्टाइड-प्रतिस्पर्धी किनेज परख का उपयोग एक ज्ञात मान्यता प्रमेय के साथ एक प्रोटीन किनेज के लिए किया जा सकता है। अगर एक किनेज की आम सहमति मान्यता वाले प्रारूप की स्थापना की जाती है, तो एक उम्मीदवार सब्सट्रेट की ब्योरात्मक फास्फोरेटेशन साइटें भविष्यवाणी की जा सकती हैं, और साइट की प्रामाणिकता मान्य की जा सकती है। इस प्रक्रिया के लिए सबसे ठोस तरीका एक उत्परिवर्ती प्रोटीन में फास्फोरायलेशन का उन्मूलन दिखा रहा है जिसमें भविष्यवाणीडी अवशेषों को गैर-फॉस्फोरेलेटलेट अमीनो एसिड ( यानी, सेरीन या थ्रेऑनिन से अलैनिन, फेरोलाइलिनिन के लिए टाइरोसिन) के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है। हालांकि, उत्परिवर्ती प्रोटीन का उत्पादन और अलगाव समय-उपभोक्ता है। अनुसंधान के प्रारंभिक चरण में एक विकल्प के रूप में प्रतिस्पर्धी पेप्टाइड कीनेस परख सरल और सुविधाजनक है। यहां, हम इन विट्रो पेप्टाइड प्रतियोगिता परख के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और फॉस्फोराइलेशन साइट के सत्यापन के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
एएमपीके द्वारा मध्यस्थता की भविष्यवाणी की गई फॉस्फोराइटलाइशन साइटों की प्रामाणिकता का आकलन करने का एक सरल और सुविधाजनक तरीका है, यहां हम इन विट्रो किनेज परख का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग प्रतिस्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कोरियाई सरकार (एमएसआईपी) द्वारा वित्त पोषित राष्ट्रीय अनुदान के राष्ट्रीय अनुसंधान संस्थान द्वारा समर्थित था (सं। 2015 आर 1 ए 2 ए 1 ए 10052663 और सं। 2014 एम 1 ए 3 ए 3 ए02034698)
Materials
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol | Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
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