Denne protokol beskriver en metode til image bosat tumor infiltrerer CD8 T celler mærket med fluorescently koblede antistoffer i menneskelige lunge tumor skiver. Denne teknik giver mulighed for real-time analyser af CD8 T celle migration ved hjælp af Konfokal mikroskopi.
CD8 T celler er vigtige aktører i kampen mod kræft. For at CD8 T celler til at dræbe tumorceller, de har brug at komme ind til svulsten, overflytte inden for tumor mikromiljø og reagere hensigtsmæssigt på tumor antigener. Den seneste udvikling af forbedrede imaging tilgange, såsom 2-foton mikroskopi, og brugen af kraftfulde musen tumor modeller har kastet lys over nogle af de mekanismer, der regulerer anti-tumor T celle aktiviteter. Sådanne systemer har givet værdifulde indsigter, de ikke altid forudsige menneskers svar. I human kommer vores viden i feltet hovedsageligt fra en beskrivelse af fast tumor prøver fra patienter, som in vitro- undersøgelser. Dog in vitro- modeller mangler det komplekse tredimensionale tumor miljø, og derfor er ufuldstændig tilnærmelser af in vivo T-celle aktiviteter. Friske skiver fremstillet af eksplanterede væv repræsenterer en komplekse multi-cellulære tumor miljø, der kan fungere som et vigtigt bindeled mellem Co kulturperler undersøgelser og dyremodeller. Oprindeligt oprettet i murine lymfeknuder1 og tidligere beskrevet i en JoVE artikel2, er denne fremgangsmåde nu blevet omsat til menneskelige tumorer at undersøge dynamikken i både forgyldt3 samt bosiddende T celler4.
Her, er en protokol for forberedelse af menneskelige lunge tumor skiver, immunfarvning af hjemmehørende CD8 T og tumor celler og sporing af CD8 T-lymfocytter i tumor mikromiljø bruger Konfokal mikroskopi beskrevet. Dette system er unikt placeret til at screene for romanen immunterapi agenter favorisere T-celle migration i tumorer.
CD8 T celler spiller en afgørende rolle i kampen mod kræft. Mange undertrykkende mekanismer forhindrer dog T-lymfocytter dræbe maligne celler. I de seneste år, er flere lovende strategier, der slipper bremserne på T-celler blevet udviklet og anvendes i klinik5. De to tilgange, der bevarer betydelig opmærksomhed er immun checkpoint-målretning antistoffer, såsom anti-PD-1 og adoptivforældre T-celle terapi. Alligevel, trods nylige succeser, kun en delmængde af patienter drage fordel af disse behandlingsformer6. En stor udfordring er at identificere mekanismer af modstandsdygtighed over for cancer immunterapi for at udvikle mere effektive behandlinger. En anden udfordring er at udvikle modelsystemer i hvilke roman behandlingsformer kan karakteriseret og testet for deres sikkerhed og potens. Hidtil har er de fleste af disse analyser baseret på in vitro- celle kultur systemer der dårligt efterligner kompleksiteten af tumor væv.
Ex vivo væv skiver er en lovende teknik, da det bevarer den oprindelige væv mikromiljø7. Gennem årene har vi oprettet denne tilgang til at spore dynamikken i T-lymfocytter i forskellige væv. Vores resultater viser, at fluorescently mærket T celler tilføjede på toppen murine lymfeknude skiver migrere ind i vævet og reagere på deres passende microenvironmental stikord1,2. På samme måde er T-lymfocytter overlejret på menneskelige lunge tumor skiver hurtigt rekrutteret til tumor stroma3. Brug af denne teknik, har vi identificeret den ekstracellulære matrix som et vigtigt element i styring af distribution og migration af T-celler i humane tumorer3,4. Fordi adfærd af ex vivo renset og forgyldt T celler afspejler ikke nødvendigvis funktionsmåden for hjemmehørende intratumoral T lymfocytter, har vi for nylig forfinet denne metode4.
Her beskriver vi en protokol for at spore bosiddende T-lymfocytter i skiver fremstillet af friske menneskelige lunge tumorer. De forskellige trin består af forberedelse af menneskelige lunge tumor skiver (herunder Agarosen indlejring og vibratome skæring af indlejrede væv), farvning af endogene T celler med fluorescerende antistoffer i frisk tumor skiver, og overvågning af disse celler med en Konfokal mikroskop.
En enkel, hurtig og robust teknik for at skabe menneskelige lunge tumor skiver og vurdering af den dynamiske opførsel af hjemmehørende CD8 T celler i en bevarede tumor miljø ved hjælp af en Konfokal mikroskop er beskrevet. Denne protokol er en videreudvikling af en tidligere JoVE artikel, der beskriver overvågning af forgyldt T celler murine lymfeknude skiver2.
Blegning af fluorescerende farvestoffer må betragtes især med første generation farvestoffer som fluorescein isothiocyanat og phycoerythrin. Vi konstateret, at der en udtalt photobleaching af direkte koblet antistoffer med en to-foton mikroskop. Omvendt, minimal photobleaching blev bemærket med Konfokal mikroskoper, især ved hjælp af lyse fluorescerende farvestoffer udviklet for nylig.
Antistoffer er forholdsvis store molekyler og deres indtrængen i vævet kan derfor være vanskeligt. Dette trin kan forbedres ved at øge inkubationstiden. Derudover farvning at anvende en mindre reagenser som direkte koblet Fab fragmenter af antistoffer repræsenterer et godt alternativ.
Alle antistoffer er beskrevet i denne protokol har tidligere valideret og kendt for at producere lys farvning4. Derfor er isotype kontrolelementer ikke påkrævet. Dog hvis ændringer til denne metode ved hjælp af andre antistoffer er ønsket, er så brug af isotype kontrol antistoffer stærkt anbefales.
Denne eksperimentelle system præsenterer nogle begrænsninger. Skæring proceduren vil skade det væv, som kan påvirke funktionsmåden af CD8 T celler, især i nærheden snitfladen. Derudover kan en række opløselige faktorer (f.eks. kemokiner) medvirkende til styring af migrationen af T-celler gå tabt. En måde at omgå disse problemer er ved at overvåge T celler beliggende på flere snese mikron fra overfladen i formentlig sundere regioner af væv. Offentliggjorte forsøg afslører, at T celler lokaliseret dybt inde i vævet vandrer mere aktivt end T celler er lokaliseret nær den cut overflade4. Vi har brugt Konfokal mikroskoper til vores undersøgelser, men det er sandsynligt, at to-foton mikroskoper vil øge den rumlige opløsning i dybden.
Denne tilgang er baseret på brug af fluorescently kombineret antistoffer, der ikke er neutrale molekyler. Fuld størrelse antistoffer er modtagelige for at påvirke den normale funktion af T-celler på forskellige måder. Først, anti-CD8 antistoffer kan ændre T-celle migration ved at udløse en intracellulær signalering cascade kan påvirke lymfocyt cytoskelet. Andet, anti-CD8 antistoffer kan modulere samspillet mellem CD8 og MHC klasse i molekyler, et vigtigt skridt i antigen anerkendelse proces. Tredje, intakt antistoffer kan binde til Fc receptorer udtrykt af mange myeloide celler distribueres i tumor og derfor modtagelige at øge uspecifikke signal. Vi har ingen tegn på, at sådan et problem påvirket vores data, sandsynligvis fordi Fc receptorer af hjemmehørende myeloide celler er, i modsætning til celler i kultur, mættet med immunoglobuliner stede i tumor milieu. Faktisk, tilsætning af serum under proceduren mærkning, en proces kendt at blokere gratis Fc receptorer, ikke ændre immuno-farvningen. Ikke desto mindre Fab fragmenter af antistoffer, blottet for Fc region, såvel som antistoffer muteret i deres Fc region og camelid-afledte antistof fragmenter8 repræsenterer andre alternative strategier til at spore bosiddende celler med fluorescerende sporstoffer.
I de sidste årtier, er flere modelsystemer blevet udviklet og anvendes til real-time imaging af T-lymfocytter. Disse omfatter in vitro- præparater af T celler tidligere renset og dyrkede med antigen-præsenterer celler. Sådanne præparater har gjort bemærkelsesværdige fremskridt med at definere mekanismerne af antigen anerkendelse og lydhørhed. Men de mangler kompleksitet af væv miljø. Andre præparater har fastslået at mere nøje efterligne struktur af en indfødt væv. Eksempler, tre-dimensionelle kollagen gel matricer i hvilke renset T celler har været indkapslet, samt kultur af reaggregated væv fragmenter er blevet brugt til at overvåge den dynamiske opførsel af T-lymfocytter med fluorescerende imaging technologies9 . Disse systemer præsentere fordel af en arkitektur, tæt på den oprindelige væv, men de mangler andre vigtige faktorer, cellulære og opløselige. I mus, er to-foton intravital mikroskopi ansat til at spore T-celler i en intakt orgel10virkelig fysiologiske miljø. Sådan tilgang er imidlertid teknisk svært at sætte op. Derudover vise musemodeller bemærkelsesværdige forskelle med det menneskets fysiologi.
Den teknik, der er beskrevet i denne protokol repræsenterer en komplekse multi-cellulære tumor miljø, der er unikt positioneret for at fungere som et vigtigt bindeled mellem Co kultur studier og dyremodeller.
Protokollen beskrevet heri kan også bruges til at spore motilitet af andre celler end CD8 T-lymfocytter som antistoffer er blevet genereret. Derudover kan teknikken tilpasses til andre menneskelige og murine tumorer og væv. Vi har eksempelvis kunnet billede i realtid dynamikken i B-celler mærket med en anti-CD19 antistof i frisk menneskelige mandler.
Den teknik, der er beskrevet i denne protokol giver mulighed for skærmen for terapeutisk molekyler kontrollerende T-celle motilitet i væv. Tilgængelighed for kultur-systemet gør det muligt at anvende nogle farmakologiske reagenser og teste deres konsekvenser for T-celle migration. Det er nu accepteret at CD8 T-celler i voksende tumorer, udviser en lav migration og reduceret kontakter med tumor celler11. Vigtigere, sparsomme forekomst af T-celler i tumor celle regioner er knyttet til et dårligt resultat og anses for at være en af resistensmekanismer til T-celle-baserede cancer immunterapi. Flere forhindringer begrænse T celler fra overflytning i tumorer er blevet identificeret, herunder en tætte ekstracellulære matrix. I denne henseende er identifikation af molekyler købedygtig genindføre T-celle motilitet og interaktion med maligne celler et vigtigt skridt i cancer immunterapi. I en tidligere undersøgelse fandt vi, at en delvis nedbrydning af kollagen med collagenase, akut anvendes til menneskelige lunge skiver, forbedrer kontakt af T-celler med tumorceller.
Endelig tilbyder muligheden for at holde menneskelige tumor skiver i kultur for op til flere dage7,12,13 en række lovende applikationer på sigt af T-celler og immunterapi.Stabiliteten i modelsystemet under lang sigt kultur er dog en vigtig parameter, der skal vurderes grundigt.
At få friske og sunde væv er en kritisk faktor til at producere kvalitet skiver med god immunfarvning af CD8 celler, tumorceller og stromale elementer. Holde tumor biopsi ved 4 ° C forud for forarbejdningen er afgørende.
Håndtering af skiver med fine pincet repræsenterer endnu et kritisk skridt i denne protokol. Dette bør udføres med stor omhu som Agarosen kan være let beskadiget. Et snit i Agarosen vil kompromittere seglet lavet af rustfrit stål vaskemaskinen resulterer i en lækage af det antistof, som indeholder løsninger.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker at takke Pierre Bourdoncle og Thomas Guilbert Cochin Imaging facilitetens (Institut Cochin, Paris) for rådgivning og bistand med mikroskoper. Dette arbejde blev støttet i en del af tilskud fra franske Ligue Nationale contre le Cancer, af CARPEM (Cancer Research for personlig medicin), af Fondation de France og af EUs Horisont 2020 forskning og innovation program under tilskud aftale nej 667980 (CARAT).
Upright confocal microscope | Leica | The use of a spinning disk confocal is recommended | |
Imaris software | Bitplane | This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
Phosphate-buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 20012019 | |
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads | Warner Instruments | 64-1415 | |
Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter | Amazon | B004K1FDGQ | |
BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 565289 | |
FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125) | Miltenyi Biotec | 130-098-113 | |
BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10) | Biolegend | 328125 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 |