نقدم بروتوكول لعزل الدهنية شظايا الاوعية الدموية الدقيقة المستمدة من الأنسجة التي تمثل وحدات الأوعية الدموية واعدة. أنها يمكن أن تكون معزولة بسرعة، لا تتطلب في تجهيز المختبر، وبالتالي يمكن استخدامها لprevascularization خطوة واحدة في مختلف مجالات هندسة الأنسجة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الفئران الدهنية المشتقة من الأنسجة الاوعية الدموية الدقيقة شظايا كما وحدات الأوعية الدموية للهندسة الأنسجة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
شبكة الاوعية الدموية الدقيقة وظيفية ذات أهمية محورية لبقاء والتكامل من بنيات الأنسجة هندسيا. لهذا الغرض، وقد وضعت عدة استراتيجيات عائية وprevascularization. ومع ذلك، وتشمل معظم النهج القائمة على الخلايا في المختبر الخطوات تستغرق وقتا طويلا لتشكيل شبكة الاوعية الدموية الدقيقة. وبالتالي، فهي ليست مناسبة لإجراءات خطوة واحدة أثناء العملية. الدهنية المشتقة من الأنسجة شظايا الاوعية الدموية الدقيقة (إعلان MVF) تمثل وحدات الأوعية الدموية واعدة. أنها يمكن أن تكون معزولة بسهولة من الأنسجة الدهنية ويحمل التشكل microvessel وظيفية. وعلاوة على ذلك، فإنها يحشدوا بسرعة إلى شبكات الاوعية الدموية الدقيقة جديدة بعد زرع في الجسم الحي. وبالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت أن إعلان MVF للحث على lymphangiogenesis. وأخيرا، فهي مصدرا غنيا للخلايا الجذعية الوسيطة، والتي قد تزيد من إمكانية المساهمة في الأوعية الدموية العالية. في دراسات سابقة أننا أظهرنا في vascularizati رائععلى قدرة إعلان MVF في هندسة العظام والجلد بدائل. في هذه الدراسة، ونحن التقرير على بروتوكول موحد لعزل الأنزيمية للإعلان MVF من الأنسجة الدهنية في الفئران.
المقدمة
وتركز هندسة الأنسجة في تصنيع الأنسجة والأعضاء البديلة التي تحتفظ، استعادة أو زيادة وظيفة غير صالحة للعمل في نظرائهم الجسم الحي 1 و 2. مصير يبني الأنسجة المهندسة يعتمد بشكل حاسم على الأوعية الدموية كافيا 3. شبكات الاوعية الدموية الدقيقة داخل هذه ثوابت ينبغي تنظيم هرمي مع الشرايين، الشعيرات الدموية، والأوردة للسماح كفاءة الارواء الدم بعد مفاغمة إلى الأوعية الدموية المستلم 4. الجيل من هذه الشبكات هو من بين التحديات الرئيسية في هندسة الأنسجة. لهذا الغرض، تم تقديم مجموعة واسعة من الاستراتيجيات الأوعية الدموية ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمعهد الوطني للمبادئ التوجيهية الصحية لاستخدام حيوانات التجارب ويتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية (Landesamt FÜR Soziales، Gesundheit اوند Verbraucherschutz، أبت. Lebensmittel- اوند Veterinärwesen، Zentralstelle، ساربروكن، ألمانيا).
1. إعداد الأدوات الجراحية
- حافظ على استعداد للمقص تشريح، ملقط جراحي، مقص إعداد صغيرة، ملقط غرامة وطبق بتري معقمة مع 15 مل Dulbecco والمتوسطة النسر المعدلة (DMEM و 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، و 100 U / مل البنسلين، 0....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذه الدراسة أجرينا ستة إجراءات العزل إعلان MVF مع الأنسجة الدهنية من 7- لمن العمر 12 شهرا من الذكور من النوع البري C57BL / 6 الفئران (يعني وزن الجسم: 35 ± 1 غرام). يوضح الشكل (1) حصاد الفئران منصات بربخي الدهون مع الميكانيكية والأنزيمية العزلة إعلان MVF اللاحقة. كان الوقت اللازم لحصاد الدهون 30 دقيقة ولعزل إعلان MVF كان 120 دقيقة. في المجموع، واستغرق إجراء 150 دقيقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الدراسة نقدم بروتوكول راسخة لعزل إعلان MVF. الحصول على إعلان MVF من الأنسجة الدهنية في الفئران هو إجراء بسيط مع عدد قليل من الخطوات الحاسمة. الفئران المعرض تحت الجلد المختلفة، ورواسب الدهون داخل البطن. كما هو موضح سابقا بالنسبة للفئران، ومصدر الدهون الأنسب لعزل إعلان MVF هي منصات بربخي الدهون بسبب حجمها، بنية متجانسة والحد الأدنى من التلوث مع الأوعية الدموية أكبر 11 و 12. في المقابل، رواسب الدهون تحت الجلد في الفئرا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
ونحن ممتنون للمساعدة التقنية الممتازة جانين بيكر، كارولين بيكلمان وروث نيكيلس. وقد تم تمويل هذه الدراسة من خلال منحة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG - مؤسسة الأبحاث الألمانية) - LA 2682 / 7-1.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الصغير المخروطي | VWR ، Kelsterbach ، ألمانيا | 700-5239 | |
| 100 - & micro ؛ ماصة L دقيقة | Eppendorf ، هامبورغ ، ألمانيا | 4920000059 | |
| ماصة قياس 10 مل | Costar ، Corning Inc. ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية | 4488 | |
| أنابيب PP سعة 14 مل | Greiner bio-one ، Frickenhausen ، ألمانيا | 187261 | |
| ماصة دقيقة 1 مل | Eppendorf ، هامبورغ ، ألمانيا | 4920000083 | |
| 500 - & micro ؛ مرشح m (pluriStrainer 500 & micro; م) | HISS ، فرايبورغ ، ألمانيا | 43-50500-03 | |
| أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل | Greiner bio-one ، فريكنهاوزن ، ألمانيا | 227261 | |
| قارورة Erlenmeyer 50 مل | VWR ، Kelsterbach ، ألمانيا | 214-0211 | |
| لوحة Greiner bio-one ذات 96 بئر | ، Frickenhausen ، ألمانيا | 65518 | |
| محلول انفصال الخلايا (Accutase) | eBioscience ، سان دييغو ، كاليفورنيا الولايات المتحدة الأمريكية | 00-4555-56 | |
| C57BL / 6 فئران | تشارلز ريفر ، كولونيا ، ألمانيا | 027 | |
| C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J الفئران | مختبر جاكسون ، بار هاربور ، الولايات المتحدة الأمريكية | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences ، هايدلبرغ ، ألمانيا | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences ، هايدلبرغ ، ألمانيا | 553354 | |
| كولاجيناز NB4G | Serva Electrophoresis GmbH ، هايدلبرغ ، ألمانيا | 17465.02 | تم اختبار الكثير من قبل الشركة المصنعة للنشاط الأنزيمي |
| مقص التشريح | Braun Aesculap AG & amp CoKG ، Melsungen ، ألمانيا | BC 601 | |
| صبغة ربط الحمض النووي (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich ، Taufkirchen ، ألمانيا | B2261 | |
| النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ؛ | PAN Biotech ، Rickenbach ، ألمانيا | P04-03600 | |
| مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) | Biochrom GmbH ، برلين ، ألمانيا | S0615 | |
| ملقط ناعم | S & T AG ، Neuhausen ، سويسرا | FRS-15 RM-8 | |
| مقص دقيق | العالم للدقة ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة | الأمريكية 503261 | |
| بديل الجلد الجلدي (Integra) | Integra Life Sciences ، Sain Priest ، فرنسا | 62021 | |
| Ketamine ؛ | Serumwerk Bernburg AG ، بيرنبورغ ، ألمانيا | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, سان دييغو, كاليفورنيا الولايات المتحدة الأمريكية | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (محلول مطهر) | Schü lke & ماير ، نوردرستيدت ، ألمانيا | 118211 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | Biochrom ، برلين ، ألمانيا | A2213 | |
| طبق بتري | Greiner bio-one ، فريكنهاوزن ، ألمانيا | 664160 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مجموعة | لونزا ، بازل ، سويسرا | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-& micro ؛ م (20 وميكرو؛ مرشح م) | تشخيص HISS ، فرايبورغ ، ألمانيا | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences ، هايدلبرغ ، ألمانيا | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences ، هايدلبرغ ، ألمانيا | 553930 | |
| مقص تحضير | صغير S & T AG ، نيوهاوزن ، سويسرا | SDC-15 R-8S | |
| ملقط جراحي | براون Aesculap AG & CoKG, Melsungen, ألمانيا | BD510R | |
| شريط (Heftpflaster Seide) 1.25 سم | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH ، ليفركوزن ، ألمانيا | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience ، سان دييغو ، كاليفورنيا الولايات المتحدة الأمريكية | 53-9760-82 | الملصقات داخل الخلايا بالإضافة إلى ذلك Cytofix / Cytoperm (BD Biosciences ، هايدلبرغ ، ألمانيا ؛ # 554722) |
المراجع
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
