इलेक्ट्रोफिज़ियोलॉजिकल स्टडीज के लिए मूरिन लघु अक्ष वेंट्रिकुलर हार्ट स्लाइसें
Summary
यहां, हम वयस्क चूहों से सक्षम वेंट्रिकुलर स्लाइस की तैयारी का वर्णन करते हैं और तेज इलेक्ट्रोड एक्शन संभावित रिकॉर्डिंग के लिए उनका उपयोग करते हैं। इन बहुकोशिकीय तैयारी ऊतक संरचना की तरह विवो में एक संरक्षित प्रदान करते हैं, जो उन्हें इन विट्रो में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और औषधीय अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल बनाता है।
Abstract
मरीन कार्डिओमोओसाइट्स को हृदय क्रिया विज्ञान के विट्रो अध्ययन और नई चिकित्सीय रणनीतियों के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। हालांकि, अलग-अलग कार्डियोमोओसाइट्स की बहुकोशिकीय तैयारी कार्डियोमायोसाइट्स, गैर-मैकोसाइट्स और बाह्य मैट्रिक्स के विवो संरचना में परिसर का प्रतिनिधित्व नहीं करती है, जो हृदय के दोनों यांत्रिक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को प्रभावित करती है। यहां हम एक तंत्र का वर्णन करते हैं जो ऊतक संरचना जैसे विवो में संरक्षित साथ वयस्क माउस के दिलों के व्यवहार्य निलय के स्लाइस तैयार करने और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए उनकी उपयुक्तता प्रदर्शित करते हैं। दिल की छांटना के बाद, वेन्ट्रिकल्स एट्रिया से अलग हो जाते हैं, जिसमें Ca 2 + -free समाधान होता है जिसमें 2,3-ब्यूटेनडीओन मोनोऑक्ज़ेम होता है और 4% कम पिघला हुआ एगरोस ब्लॉक में एम्बेडेड होता है। ब्लॉक को एक हिलिंग ब्लेड के साथ एक माइक्रोोटिम पर रखा गया है, और 150-400 माइक्रोन की मोटाई के साथ ऊतक के स्लाइस कंपन फ्रेडर को तैयार किए जाते हैं।60-70 हर्ट्ज पर ब्लेड की समाप्ति और ब्लेड को आगे बढ़ने से धीरे-धीरे आगे बढ़ना स्लाइस की मोटाई आगे के आवेदन पर निर्भर करती है। स्लाइस बर्फ ठंड टरोड के समाधान में 0.9 मिमी सीए 2 + और 2 3-ब्यूटेनएडीओन मॉन्क्ऑक्सियम (बीडीएम) के 30 मिनट के लिए संग्रहीत होते हैं। इसके बाद, स्लाइस को 37 डिग्री सेल्सियस डीएमईएम को 30 मिनट के लिए स्थानांतरित किया जाता है ताकि बीडीएम को धोया जा सके। सिकुड़ाए कार्य का विश्लेषण करने या प्रत्यारोपित स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोयोमोसाइट्स और होस्ट टिशू के संपर्क की जांच करने के लिए बल माप के लिए, स्लाइस का उपयोग तीव्र इलेक्ट्रोड या माइक्रो इलेक्ट्रोड एरेज़ के साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के लिए किया जा सकता है। तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के लिए, एक औंधा माइक्रोस्कोप के ताप प्लेट पर 3 सेमी सेल कल्चर डिश में एक टुकड़ा रखा गया है। एक एकध्रुवीय इलेक्ट्रोड के साथ टुकड़ा को प्रेरित किया जाता है, और टुकड़ों के भीतर कार्डियोमोसाइट्स के अंतःक्रियात्मक एक्शन क्षमताएं तेज कांच इलेक्ट्रोड के साथ दर्ज की जाती हैं।
Introduction
यममोट और एमक्लवेन से पता चला कि 1 9 66 में मस्तिष्क के स्लाइस की बिजली की गतिविधि इन विट्रो 1 में बनाए रखी गई थी, क्योंकि मूल विज्ञान में पतली टिशू स्लाइस का प्रयोग अक्सर किया जाता है। तब से, मस्तिष्क 2 , यकृत 3 , फेफड़े 4 और मैकार्डियल टिशू 5 , 6 , 7 से स्लाइस पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और औषधीय अध्ययन किए गए हैं। नवजात शिशु के हृदय से वेंट्रिकुलर स्लाइस में पहला पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग 1 9 8 8 में वर्णित है, लेकिन यह तकनीक कुछ समय के लिए विस्मृति में गिर गई। एक दशक से भी अधिक समय तक, हमारे समूह ने म्यूरीन भ्रूणीय 9 , नवजात 10 और वयस्क 11 दिल के स्लाइस तैयार करने के लिए एक नई विधि स्थापित की। इन व्यवहार्य टिशू स्लाइस का प्रयोग तीव्र प्रयोगों के लिए किया जा सकता है (वयस्क स्लाइसकई घंटे तक खेती की जा सकती है) या अल्पकालिक संस्कृति प्रयोगों (भ्रूण और नवजात के स्लाइस कुछ दिनों के लिए खेती की जा सकती हैं)। स्लाइसें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं की तरह विवो में दिखाती हैं और तीव्र इलेक्ट्रोड एक्शन संभावित और माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणी रिकॉर्डिंग द्वारा मूल्यांकन के रूप में समरूप उत्तेजना फैलता है। उनके "दो आयामी" आकारिकी के कारण, वे वेंट्रिकल के सभी क्षेत्रों में इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग की सीधे पहुंच की अनुमति देते हैं, जो उन्हें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच के लिए एक दिलचस्प उपकरण बनाता है और लैंगेंडॉरफ-पेर्फस पूरे दिल के मुकाबले नए प्रयोगात्मक विकल्पों को बढ़ाता है। आयन चैनल ब्लॉकर्स के लिए वारामपिल (एल-टाइप सीए 2 + – चैनल ब्लॉकर), लिडोकाइन (ना + – चैनल ब्लॉकर), 4-एमिनपीरिडाइन (अनएक्लेक्टिव वोल्टेज निर्भर के + + चैनल ब्लॉकर) और लिनोपर्डाइन (केसीएनक्यू के) + -चैनल ब्लॉकर) 9 , 11 </suपी> अलग-अलग कार्डियोयोमोसाइट्स पर ज्ञात प्रभावों से मेल खाती है। आइसोमेट्रिक फोर्स मापन ने एक सकारात्मक बल आवृत्ति रिश्ते का खुलासा किया और दृढ़ता से अनुशंसित सिकुड़ी कार्य 10 का सुझाव दिया। इन निष्कर्षों से पता चला है कि म्यूरीन वेंट्रिकुलर स्लाइड्स शारीरिक और औषधीय अध्ययनों के लिए इन विट्रो ऊतक मॉडल के रूप में उपयुक्त हैं। इसके अलावा, तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के साथ मिलकर प्राप्तकर्ता के दिल की निचली स्लाइस ने इलेक्ट्रिकल और मैकेनिकल एकीकरण के साथ-साथ प्रत्यारोपित भ्रूण 12 , 13 , 14 की स्टेम सेल-व्युत्पन्न 15 कार्डियोमोसाइटोइट्स के गुणांकन के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण साबित किया है।
संक्षेप में, वेन्ट्रिकुलर स्लाइस एक बहुमूल्य और अच्छी तरह से स्थापित बहुकोशिकीय ऊतक मॉडल हैं और इसे अलग-अलग कार्डिओमायोसाइट्स और लैंगेंडॉरफ-पेर्फेट दिल के पूरक माना जाना चाहिए।कार्डियोवास्कुलर रिसर्च में, ऊतक संरचना (जैसे कि अलग-अलग कोशिकाओं के विपरीत) में विवो में मुहैया कराने के साथ ही हृदय के सभी क्षेत्रों में तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग जैसे संपूर्ण तकनीकों की प्रत्यक्ष पहुंच जैसे पूरे दिल की तैयारी के विपरीत।
Protocol
Representative Results
Discussion
वेंट्रिकुलर स्लाइस, हृदय के सभी क्षेत्रों में ऊतक संरचना और माप प्रौद्योगिकी की प्रत्यक्ष पहुंच जैसे विवो में संरक्षित साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल, फार्माकोलॉजिकल और मैकेनिकल अध्ययन को सक्ष?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कार्यशालाओं और न्यूरोफिज़ियोलॉजी संस्थान की पशु सुविधा द्वारा प्रदान किए गए समर्थन को स्वीकार करते हैं। यह काम वाल्टर अंड मार्ग बोले-स्टिचुंग, कोल्न फॉर्च्यून और ड्यूश स्टिफ़ंग फर हेर्ज़फ़ोर्सचुंग द्वारा समर्थित था।
Materials
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 ml Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27Gx3/4“ Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20G 11/2“ Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
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