Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for elektrofysiologiske studier

Summary

Her beskriver vi utarbeidelsen av levedyktige ventrikulære skiver fra voksne mus og deres bruk for skarpe elektrodevirkningspotensialopptak. Disse multicellulære preparatene gir en bevart in vivo- lignende vevstruktur, noe som gjør dem til en verdifull modell for elektrofysiologiske og farmakologiske studier in vitro .

Abstract

Murine kardiomyocytter har blitt omfattende brukt for in vitro studier av hjertefysiologi og nye terapeutiske strategier. Imidlertid er multikellulære preparater av dissocierte kardiomyocytter ikke representative for den komplekse in vivo strukturen av kardiomyocytter, ikke-myocytter og ekstracellulær matrise, som påvirker både mekaniske og elektrofysiologiske egenskaper av hjertet. Her beskriver vi en teknikk for å forberede levedyktige ventrikulære skiver av voksne mushjerter med en bevart in vivo- lignende vevstruktur og demonstrere deres egnethet til elektrofysiologiske opptak. Etter ekspisjon av hjertet, separeres ventrikler fra atriene, perfuseres med Ca2 ⁺ -fri oppløsning inneholdende 2,3-butandionmonoksy og innebygd i en 4% lavmeltig agaroseblokk. Blokken er plassert på en mikrotome med et vibrerende blad, og vevskiver med en tykkelse på 150-400 μm er forberedt og holder vibrasjonen friBladets vinkel ved 60-70 Hz og flytter bladet fremover så sakte som mulig. Tykkelsen på skivene avhenger av den videre applikasjonen. Skiver lagres i iskald Tyrode-løsning med 0,9 mM Ca ²⁺ og 2,3-butandionmonoksim (BDM) i 30 minutter. Etterpå overføres skiver til 37 ° C DMEM i 30 minutter for å vaske ut BDM. Skiver kan brukes til elektrofysiologiske studier med skarpe elektroder eller mikroelektroder, for kraftmålinger for å analysere kontraktil funksjon eller for å undersøke samspillet mellom transplanterte stamceller-avledede kardiomyocytter og vertsvev. For skarpe elektrodeopptak, plasseres et stykke i en 3 cm cellekulturrett på oppvarmingsplaten av et invertert mikroskop. Skiven stimuleres med en unipolar elektrode, og intracellulære virkningspotensialer av kardiomyocytter i skiven registreres med en skarp glasselektrode.

Introduction

Tynne vevstykker har blitt brukt ofte i grunnvitenskap siden Yamamot og Mcllwain viste i 1966 at elektrisk aktivitet av hjerneskiver beholdes in vitro ¹ . Siden da har elektrofysiologiske og farmakologiske studier blitt utført på skiver fra hjerne ² , lever ³ , lunge ⁴ og myokardialt vev ^{5 , 6 , 7} . Første patch-clamp opptak i ventrikulære skiver fra neonatal rotte hjerter ble beskrevet i 1990 ⁸ , men denne teknikken falt i glemsel i noen tid. Mer enn ett tiår senere etablerte vår gruppe en ny metode for å forberede murine embryonale ⁹ , neonatal ¹⁰ og voksne ¹¹ hjerte skiver. Disse levedyktige vevskiver kan brukes til akutte eksperimenter (voksen skiveS kan dyrkes i flere timer) eller kortsiktige kulturforsøk (embryonale og neonatale skiver kan dyrkes i noen dager). Skiver viser in vivo som elektrofysiologiske karakteristika og et homogent eksitasjonsspred som vurderes ved skarpt elektrodevirkningspotensiale og mikroelektrodopptak ¹¹ . På grunn av deres "todimensjonale" morfologi tillater de direkte innspillingselektroder til alle områder i ventrikkelen, noe som gjør dem til et interessant verktøy for elektrofysiologiske undersøkelser og gir nye eksperimentelle muligheter i forhold til Langendorff-perfuserte hele hjerter. Legemiddelrespons av skivene til ionkanalblokkere som verapamil (L-type Ca ²⁺ -kanalblokker), lidokain (Na ⁺ -kanalblokkering), 4-aminopyridin (ikke-spenningsavhengig K ⁺ -kanalblokker) og linopirdin (KCNQ K ⁺ -kanalblokker) ^{9 , 11} </suP> korresponderte med kjente effekter på dissocierte kardiomyocytter. Isometriske kraftmålinger avslørte et positivt kraftfrekvensforhold og sterkt foreslått intakt kontraktil funksjon ¹⁰ . Disse funnene viste at murine ventrikulære skiver er egnet som en in vitro vevsmodell for fysiologiske og farmakologiske studier. Videre har ventrikulære skiver av mottakerhjerter i kombinasjon med skarpe elektrodeopptak vist seg å være et svært nyttig verktøy for å karakterisere elektrisk og mekanisk integrasjon, i tillegg til modning av transplanterte føtal ^{12 , 13 , 14} og stamceller-avledede ¹⁵ kardiomyocytter.

Sammendrag er ventrikulære skiver en verdifull og veletablert multicellular vevsmodell, og bør betraktes som komplementære til dissocierte kardiomyocytter og Langendorff-perfuserte hjerterI kardiovaskulær forskning, med den største fordelen ved å gi en in vivo- lignende vevsstruktur (i motsetning til dissocierte celler) samt direkte tilgang til målteknologier som skarpe elektrodeopptak til alle hjerteområder (i motsetning til hele hjertepreparater).

Protocol

Dyrehåndtering skal være i samsvar med retningslinjene fra det lokale dyrevelferdsutvalget og til Europa-Parlamentets direktiv 2010/63 / EU. 1. Forbered løsninger Klargjør Tyrodes løsning uten Ca 2+ (sammensetning i mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, glukose 10, HEPES 5, 2,3-butandionmonoksim (BDM) 30. Juster pH til 7,4 Med NaOH ved 4 ° C. Klargjør Tyrodes løsning med Ca 2+ (sammensetning i mM…

Representative Results

Myokardinfarkt fører til et nesten uopprettelig tap av kardiomyocytter. Celleutskiftningsterapi ved hjelp av stamceller-avledede kardiomyocytter for eksogen hjerteregenerering er en lovende terapeutisk tilnærming. Elektrisk integrasjon og modning av de transplanterte cellene er avgjørende for sikkerhet og effektivitet av celleutskiftningsterapi. For å vurdere integrasjon og modning, transplanterte vi kardiomyocytter avlede…

Discussion

Ventrikulære skiver muliggjør elektrofysiologiske, farmakologiske og mekaniske studier med en bevaret in vivo- lignende vevstruktur og direkte tilgang til målteknologi til alle hjerteområder. Fysiologiske virkningspotensialegenskaper har blitt påvist i embryonale, neonatale og voksne skiver ^{9 , 10 , 11} . Skivens vitalitet, unntatt overflatelagene som er direkte skadet av skåret, har blitt bekreftet av vitalitetsf…

Materials

Leica VT 1000s	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		Microtome with vibrating blade.
Stainless Steel Blades	Campden Instruments, Loughborough, England	7550-1-SS
Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	Z627992
Fine brush, e.g. size 6 (4/32")	VWR, International, Radnor, USA	149-2125
Preparation table			self made
Molt for embedding ventricles in agarose			self made
1 ml Syringe	Becton, Dickinson;  Franklin Lakes, USA	300013
27Gx3/4“ Needles	Braun, Melsungen, Germany	4657705
20G 11/2“ Needles		4657519
Small scissor	WPI, Sarasota, USA	501263
Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip	WPI, Sarasota, USA	500342
Oxygen gas (medical grade O2)	Linde, Munich, Germany
Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2)	Linde, Munich, Germany
NaCL	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	7647-14-5
KCL	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746436
CaCl2	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746495
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	NIST200B
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	51558
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S5761
D(+)-Glucose	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	G8270
MgSO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	M7506
NaOH	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S8045
Cyanoacrylate glue	Henkel, Düsseldorf, Germany
Low-melt Agarose	Roth, Karlsruhe, Germany	6351.2
Heparin-sodium-25000 I.E./5mL	Ratiopharm, Ulm, Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM), high glucose, GlutaMAX	ThermoScientific, Waltham, USA	10566016
SEC-10LX Amplifier	npi electronic GmbH, Tamm, Germany	SEC-10LX
EPC 9	HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany
Zeiss Axiovert 200	Zeiss, Oberkochen, Germany
Low magnification Micromanipulator	Narashige, Tokyo, Japan	Nm-3
High magnification, three-axis micromanipulator	Narashige, Tokyo, Japan	MHW-3
Peristaltic perfusion pump	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	PPS2
2-channel temperature controller	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	TCO02
Square pulse stimulator	Natus Europe GmbH, Planegg, Germany	Grass SD9
Glass capillaries	WPI, Sarasota, USA	1B150F-1