यहां, हम एक स्टेरिओलॉजिकल मेथड, ऑप्टिकल फूटेटर, जो कि न्यूरॉन्स के गठन का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, और उनके अस्तित्व को, इलेक्ट्रोकॉनविल्सिव उत्तेजना के बाद चूहे हिप्पोकैम्पस में प्रस्तुत करते हैं। जब सही ढंग से कार्यान्वित किया जाता है, स्टिरीओलॉजिकल तरीके की संवेदनशीलता और दक्षता एक निश्चित और पूर्वनिर्धारित परिशुद्धता के साथ सटीक अनुमान को सुनिश्चित करती है।
स्तरीय तरीके से कोशिकाओं या संरचनाओं के आकार, आकार, अभिविन्यास और वितरण के बारे में धारणाएं किए बिना, मात्रात्मक मापदंडों का वर्णन करने के लिए तैयार किए गए हैं। ये तरीकों स्तनधारी मस्तिष्क के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए क्रांतिकारी रही हैं, जिसमें मात्रात्मक सेल आबादी स्वयं को गिनने में बहुत अधिक है, और त्रिविक्यता अब पसंद की तकनीक है, जब भी त्रि-आयामी मात्रा का अनुमान दो-आयामी पर माप से निकालने की आवश्यकता होती है वर्गों। सभी स्टिरियोलॉजिकल तरीके सिद्धांत में निष्पक्ष हैं; हालांकि, वे रुचि की संरचना और ऊतकों की विशेषताओं के बारे में उचित जानकारी पर भरोसा करते हैं। स्ट्रीयोलॉजी, व्यवस्थित समान रूप से यादृच्छिक नमूनाकरण (एसआरएस) पर आधारित है, जो सटीकता के संबंध में सबसे कुशल स्तर पर नमूने के समायोजन के साथ, ब्याज की पूरी संरचना के बारे में विश्वसनीय, मात्रात्मक जानकारी प्रदान करती है। यहां हम ब्र्डीयू इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री टी के साथ ऑप्टिकल फिक्टेटर पेश करते हैंO इलेक्ट्रोकाँवल्जेसिस उत्तेजना के बाद चूहे हिप्पोकैम्पस के ग्रेन्युल सेल परत (उप-दानेदार क्षेत्र सहित) में नवगठित न्यूरॉन्स के उत्पादन और अस्तित्व का अनुमान है, जो न्यूरोजेनेसिस के सबसे शक्तिशाली प्रेरक के बीच है। ऑप्टिकल फूटेटर तकनीक पूरी संरचना से नमूने मोटी भागों से कुल कोशिकाओं के अनुमानों को प्रदान करने के लिए डिज़ाइन की गई है। मोटे वर्ग अपने पूर्ण 3-डी हद तक कोशिकाओं का निरीक्षण करने का अवसर प्रदान करते हैं और इस प्रकार, रूपवाचक मानदंडों के आधार पर आसान और मजबूत सेल वर्गीकरण के लिए अनुमति देते हैं। जब सही ढंग से कार्यान्वित किया जाता है, ऑप्टिकल फूटेटर की संवेदनशीलता और दक्षता एक निश्चित और पूर्वनिर्धारित परिशुद्धता के साथ सटीक अनुमान प्रदान करता है।
तीन-आयामी (3-डी) संरचना में कोशिकाओं की मात्रा को निष्पक्ष सिद्धांतों के आधार पर अनुमान प्राप्त करने की आवश्यकता हो सकती है। आज भी, अध्ययन अक्सर 3-डी संरचनाओं के डेटा की रिपोर्ट करने के लिए दो-आयामी (2-डी) तरीके का उपयोग करते हैं हालांकि, ये पद्धतियां संरचनात्मक संरचना की आकृति और वितरण के संदर्भ में संरचना की विषम प्रकृति पर विचार नहीं करती है जिसके परिणामस्वरूप प्रणालीगत सीमाएं होती हैं; वे ब्याज की 3-डी ढांचे के बारे में धारणा करते हैं और परिणाम पूरी संरचना का उल्लेख नहीं करते हैं। ये सीमाएं तरीकों की संवेदनशीलता और सटीकता को कम करती हैं और साथ ही साथ त्रुटियों के जोखिम को बढ़ाती हैं 1 ।
कोशिका की गिनती में पूर्वाग्रह डिजाइन-आधारित स्टिरिओलॉजी के आवेदन से बचा जा सकता है, जो किसी दिए गए ऊतक या संरचना में कोशिकाओं की संख्या के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए सामान्य महत्व का है। हालांकि स्टिरियोलॉजी पूर्व में बहुत समय लेने वाली विधि रही है, प्रक्रियाओं में प्रगति, मुलायमबर्तन और इमेजिंग, यह बहुत अधिक कुशल और व्यापक रूप से लागू हो गया है। स्टिरियोलॉजी सांख्यिकीय नमूनाकरण सिद्धांतों और स्टोकेस्टिक जियोमेट्रिक सिद्धांत पर जोर देती है ताकि 2-डी खंड 2 में नमूनाकरण द्वारा 3 डी संरचना में मात्रा, सतह क्षेत्र, लंबाई, और वस्तुओं की संख्या के अनुमान के लिए कुशल उपकरण प्रदान किया जा सके। इस प्रकार, स्टिरियोलॉजी एक ऊतक वर्गों में संरचनात्मक परिवर्तनों पर निष्पक्ष मात्रात्मक आंकड़े प्राप्त करने की अनुमति देती है, जो संपूर्ण विश्लेषण के बिना औसत संख्याओं के औसत अनुमान देते हैं 1 । स्टिरियोलॉजी को नमूने वाली जानकारी से ज्यामितीय पैरामीटर के सांख्यिकीय अनुमान के रूप में परिभाषित किया गया है। यह निष्पक्ष नमूनाकरण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जो कि खंडों का व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना कहना है, साथ ही नियमों की गणना भी करता है जो यह सुनिश्चित करता है कि सभी वस्तुओं की समानताएं 3 की गणना की जा रही हैं जबकि स्टिरीओयोलॉजिकल परिणामों में त्रुटि की गुणांक (सीई) के संकेत के अनुसार सटीक डिग्री भिन्न हो सकते हैं, यह विज्ञापन हो सकता हैअपेक्षित 4 , 5 के अनुसार नमूनाकरण की मात्रा को समायोजित करके अंतर्निहित जैविक विचरण (भिन्नता का गुणांक (सीवी)) के अनुरूप होना चाहिए। कुछ पिछले स्टिरीओयोलॉजिकल अध्ययन ने 671 में कृन्तकों में हिप्पोकैम्पल प्लास्टिसिटी पर इलेक्ट्रोकोनिवल्सी उत्तेजना (ईसीएस) के अल्पावधि प्रभावों की जांच की है। इन अध्ययनों के डेटा में बार-बार ईसीएस के बाद न्यूरॉन्स की कुल संख्या और साथ ही ऊंचा synaptic भिन्नता में एक प्रारंभिक वृद्धि दिखाई देती है। हालांकि, ये अध्ययन न्यूरोजेनेसिस का अनुमान नहीं लगाते हैं, क्योंकि वे सेल प्रसार के लिए विशिष्ट मार्करों का उपयोग नहीं करते हैं।
यहां हम उप-दानेदार क्षेत्र (एसजीजेड) सहित चूहा हिप्पोकैम्पल ग्रेन्युल सेल परत (जीसीएल) में नवगठित न्यूरॉन्स की कुल संख्या को मापने के लिए, एक स्ट्राइकोलॉजिकल विधि, ऑप्टिकल फूटेटर तकनीक 8 , 9 की एक आवेदन पेश करते हैं अपने दीर्घकालिक एस के रूप मेंUrvival 10 , 11 हमने चूहों को ईसीएस (तीन हफ्ते के तीन हफ्ते में तीन बार) के एक नैदानिक प्रासंगिक कार्यक्रम के अधीन किया, जो कि न्यूरोजेनेसिस 12 के सबसे शक्तिशाली उत्तेजक पदार्थों में से एक है। नियंत्रण जानवरों को उसी प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए इलाज किया गया था, लेकिन वर्तमान से गुजरने के बिना। प्रयोग के 21 दिनों में से प्रत्येक पर, सभी चूहों को 5-ब्रोमो-2-डीनोकाउराइडिन (बीआरडीयू) के साथ इंट्राप्टरिटोनियल इंजेक्ट किया गया था जो कोशिका विभाजन 13 के दौरान थाइमिडीन की जगह डीएनए में शामिल होता है। प्रयोग के बाद, चूहों को चार अलग-अलग समय अवधि (24 घंटे, 3 महीने, 6 महीने और 12 महीने) के लिए बनाए रखा गया था अंशक सिद्धांत का प्रयोग करते हुए, हम हिप्पोकैम्पस के वर्गों के वर्दी यादृच्छिक नमूने के माध्यम से एक ज्ञात अंश प्राप्त कर चुके हैं, और नमूने और प्रतिरक्षी मोटी ऊतक वर्गों के लिए ऑप्टिकल डिस्क्टेक्टर (3-डी जांच) लगाए हैं। यह विशेष रूप से नोट किया जाता है कि प्रक्रिया के दौरान जमे हुए वर्ग आमतौर पर z-axis में गिर जाते हैंआईएनजी, और इस विशेष मामले 14 में संख्या-भारित माध्य खंड मोटाई के आधार पर ऑप्टिकल डिस्कार्स का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। चूंकि ऑप्टिकल डिस्कोक्टरों के फोकल प्लेन को अनुभाग के माध्यम से एक ज्ञात दूरी को स्थानांतरित कर दिया गया था, जब ब्र्ड्यू-पॉजिटिव न्यूरॉन्स गिने गए थे, जब ब्याज की उनकी सुविधा स्पष्ट रूप से मान्यता प्राप्त थी। स्टिरियोलॉजी के क्षेत्र में कणों की कुल संख्या के बारे में कोई बहस है जो कि 15 गिना जानी चाहिए; आम तौर पर 150-200 न्यूरॉन्स को पर्याप्त सटीक यानी 7-8% 8 के गुणांक प्राप्त करने के लिए ब्याज की संरचना में गिना जाता है। कैमरे से लैस मानक माइक्रोस्कोप द्वारा इमेजिंग के साथ ब्रोड्यू-पॉजिटिव न्यूरोनल मायनेक्स का पूरा पूरा किया गया और निम्न उद्देश्य: 2 एक्स, 4 एक्स और 10 एक्स तथा साथ ही 100 एक्स ऑयल-विसर्जन उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर = 1.40), और मोटर चालित चरण । जेड-दिशा में आंदोलनों को एक डिजिटल माइक्रोकेटर के साथ मापा गया। अंतिम बढ़ाईथा 3000X
न्यूरोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए एक पद्धति के रूप में ईसीएस का उपयोग करना, हम हिप्पोकैम्पस में नए ब्रोड्यू-पॉजिटिव न्यूरॉन्स के गठन में 260% की तत्काल वृद्धि पाते हैं। तीव्रता से उत्पन्न न्यूरॉन्स के इस पूल में हमें दिन 1 से तीन महीनों में 40% अतिक्रमण मिला, साथ ही नवगठित न्यूरॉन्स का लगभग 50% उपचार 10 , 11 के बाद कम से कम 12 महीने से जीवित रहे। ब्रॉडयू-लेबल न्यूरॉन्स की गिनती एक कठोर नमूनाकरण योजना का पालन करती है, जिसके तहत पूरे हिप्पोकैम्पस को प्रत्येक 5 वें खंड के उप-नमूना के बाद 80-माइक्रोग्राम-मोटे वर्गों में कटौती की गई थी, जिसमें खंड 1 और खंड पांच के बीच यादृच्छिक नमूना शुरू हो गया था। इन वर्गों को प्रदान करना एक व्यवस्थित यादृच्छिक तरीके से चुना जाता है, यह अंतिम रूप से भिन्न होने वाले गिनती के बिना अंतिम परिणाम के विचरण को कम करने का एक शानदार तरीका है। इस नमूनाकरण योजना ने हमें 12 (8-16) हिप्पोकैम्प की औसत में ब्रोड-पॉजिटिव न्यूरॉन्स को गिनने की अनुमति दीप्रत्येक चूहे मस्तिष्क में अल सेक्शन, 9-11% की अंतिम परिशुद्धता के साथ।
अंशक विधि का उपयोग करते समय, अनुभाग ऊँचाई के अंश का पता होना जरूरी है जिसमें गिनती की जाती है, क्योंकि ऊतक संकोचन और विकृति अक्सर हास्टोलॉजिकल प्रसंस्करण 14 के दौरान होती है दरअसल, हमने इस अध्ययन में मोटाई का पर्याप्त संकोचन देखा है। इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अंतर ऊतक संकोचन हो सकता है, जैसा कि Dorph-Petersen एट अल में प्रस्तुत किया गया है हालांकि, जब तक विश्लेषण के लिए ब्याज की पूरी संरचना उपलब्ध होती है, तब तक इन सीमाओं की कुल संख्या में कणों का पूर्वाग्रह नहीं होता है, अर्थात ईआरडीयू पॉजिटिव न्यूरॉन्स। अध्ययन में जहां ऊतक संकोचन एक विशेष मुद्दा है, यह हमेशा कहा जाना चाहिए कि परिणाम विकृत ऊतक में प्राप्त होते हैं। इस अध्ययन में, हम 10 माइक्रोन की एक वेक्टर की ऊंचाई में गिना। वर्तमान अध्ययन के अनुभागों में 26 माइक्रोन का एक अंतिम मतलब मोटाई, 5 माइक्रोन थाखंड के शीर्ष पर गार्ड क्षेत्र और 11-माइक्रोन (मध्य) गार्ड जोन। ये पैरामीटर स्वीकार्य हैं क्योंकि गार्ड जोन लगभग नमूनाकृत कणों का व्यास होना चाहिए।
जीसीएल / एसजीजेड के चित्रण के बाद, डिटेक्टरों को एक समान रूप से यादृच्छिक क्षेत्र में रखा गया। वेक्टर को एक निश्चित चरण लंबाई के साथ रखा जाना चाहिए, जो जांचकर्ता द्वारा निर्धारित परिशुद्धता के साथ अनुमान प्राप्त करने के लिए नमूनाकरण और गिनती का अनुकूलन करता है। इष्टतम परिशुद्धता आमतौर पर ब्याज 5 की प्रत्येक संरचना में 150-200 कोशिकाओं तक की गणना करके प्राप्त की जाती है। वर्तमान अध्ययन में, हमने प्रत्येक चूहा हिप्पोकैम्पस में 133 (श्रेणी 33-372) ब्रॉडयू पॉजिटिव न्यूरॉन्स का मतलब गिना। नियंत्रण जानवरों में से कुछ में कम सेल संख्या के कारण, ब्रोड्यू-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की हमारी गिनती एक उचित परिशुद्धता प्राप्त करने के लिए आम तौर पर स्वीकार्य संख्याओं की संख्या से नीचे होती है, जिसके परिणामस्वरूप उन मामलों के लिए अपेक्षाकृत उच्च सीई मानों का परिणाम होता है। एचचूंकि हमने कम से कम सीवी-मूल्यों के सीई-वैल्यू प्राप्त की (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें) अतिरिक्त नमूना और गिनती आवश्यक नहीं थी। उच्च सीवी-मान दर्शाते हैं कि मनाया भिन्नता के लिए सबसे बड़ा योगदानकर्ता जैविक भिन्नता से उत्पन्न होता है। दरअसल, हम यह कह सकते हैं कि वर्तमान अध्ययन में गिना जाने वाले ब्रॉडयू पॉजिटिव न्यूरॉन्स की औसत संख्या आवश्यक से अधिक थी। उदाहरण के लिए, चूहों के एक समूह में हमने 9% का सीई-वैल हासिल किया, और 43% का सीवी-मूल्य देखा। इस विशेष मामले में, हम लगभग 20% की एक सटीक लक्ष्य निर्धारित कर सकते थे संक्षेप में, वर्तमान अध्ययन में ब्रॉडयू-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की कुल संख्या का सटीक पर्याप्त है, क्योंकि यह वास्तविक कणों की वास्तविक संख्या पर वास्तविक उपचार प्रभाव को पकड़ता है। प्रयासों के कम व्यय के बावजूद जानवरों के कुछ समूहों में होने वाले बड़े जैविक भिन्नता के कारण ही एक स्वीकार्य सटीकता के साथ ही अनुमान प्राप्त किया जा सकता था। समूहों के भीतर उच्च जैविक भिन्नताएं ही हो सकती हैंजानवरों की संख्या में वृद्धि करके मुआवजा दिया जाएगा
एक यह तर्क दे सकता है कि सटीक सेल संख्या प्राप्त करने के लिए सोने के मानक में रुचि की सभी वस्तुओं की संपूर्ण गणना होती है। हालांकि, मस्तिष्क के अधिकांश अध्ययनों में यह कोशिकाओं की विशाल संख्या के कारण संभावना नहीं है। संपूर्ण कोशिका की गिनती के मुकाबले अधिक कुशल होने के बावजूद, वैकल्पिक खंडक अपेक्षाकृत समय से सेल नंबरों में अंतर की सरल जांच के मुकाबले उपभोग करता है, जो कि अगर कोशिकाओं की सही संख्या आवश्यक नहीं है। यह हमारा अनुभव है कि 20-30% से अधिक के अंतर को स्क्रीनिंग प्रक्रियाओं द्वारा विशुद्ध रूप से पाया जा सकता है।
यदि सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है, तो डिजाइन-आधारित स्टिरिओलॉजी का उपयोग करने का नमूना एक कुशल तरीके से निष्पक्ष और सटीक अनुमान प्रदान करता है 1 । स्टिरिओलॉजी की निष्पक्ष संपत्ति का अनुमान है कि, जब दोहराया जाता है, सच्चा आबादी का अनुमान लगाया जाता है, और इसके पुनरुत्पादन को बढ़ाया जाता हैअनुमान 21 प्रारंभ में, ब्याज की संपूर्ण संरचना का एक प्रतिनिधि नमूना (इस अध्ययन में हिप्पोकैम्पल जीसीएल / एसजीजेड) प्राप्त होना चाहिए, जिसमें खंड 4 के सांख्यिक रूप से मान्य उपसमुच्चय में अनुमान लगाने की अनुमति दी जायेगी। किसी उपयुक्त वर्गों को प्राप्त करने के लिए और जांच की जा रही है कि हम एसआरएस को लागू करते हैं, जो यादृच्छिक नमूनाकरण 8 की तुलना में भिन्नता को कम करता है। इसके अलावा, शूर यह सुनिश्चित करता है कि संरचना के भीतर ब्याज के कणों की संरचना में उनके आकार, आकृति, अभिविन्यास और वितरण से अलग, एक ही संभावनाओं के साथ नमूने किए जाते हैं। जैसे कि सटीक और निष्पक्ष अनुमान प्राप्त करने पर इस तरह की स्टिरीओला को अत्यधिक अनुशंसित किया जाना है, परियोजना का एक केंद्रीय पहलू है।
The authors have nothing to disclose.
कुशल तकनीकी सहायता के लिए हम सुज़ैन सोरेनसेन का शुक्रिया अदा करते हैं। यह काम द वेलक्स फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित था; जस्का फाउंडेशन; एसे और ईजनार डेनियलेंस फाउंडेशन; हार्टमैन ब्रदर्स फाउंडेशन; निर्देशक याकूब मैडसेन और पत्नी ओल्गा मैडेंस फाउंडेशन; डॉक्टर सोफस कार्ल एमिल फ़िरीस और डोरिस फ्रीस ट्रस्ट; 1870 की फाउंडेशन; Torben और ऐलिस Frimodts फाउंडेशन और न्यूरोलॉजिकल रिसर्च के लिए फाउंडेशन। इनगलवुड बायोमेडिकल एडिटिंग द्वारा पांडुलिपि संपादन किया गया था
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |