Met behulp van een lipofiele l, 3'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI) kleuringstechniek, kan Ambystoma mexicanum vasculaire perfusie ondergaan om de vasculatuur gemakkelijk te visualiseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
DiI perfusie als een methode voor vasculaire visualisatie in
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Perfusionstechnieken zijn eeuwenlang gebruikt om de circulatie van weefsels te visualiseren. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is een soort salamander die is uitgekomen als een essentieel model voor regeneratie studies. Er is weinig bekend over hoe revascularisatie zich voordoet in de context van regeneratie bij deze dieren. Hier rapporteren wij een eenvoudige methode voor visualisatie van de vasculatuur in axolotl via perfusie van 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI). DiI is een lipofiele carbocyanine kleurstof die onmiddellijk in het plasmamembraan van endotheliale cellen inslaat. Perfusie wordt gedaan met behulp van een peristaltische pomp, zodat DiI de circulatie door de aorta binnentreedt. Tijdens perfusie vloeit de kleur door de bloedvaten van de axolotl en voegt zich in contact met de lipide bilayer van vasculaire endotheelcellen. De perfusieprocedure duurt ongeveer een uur voor een acht-inch axolotl. Onmiddellijk na perfusie wiTh DiI, kan de axolotl met een confocale fluorescerende microscoop worden weergegeven. De DiI licht licht in het rood-oranje bereik uit wanneer het opgewekt wordt met een groen fluorescerend filter. Deze DiI perfusie procedure kan gebruikt worden om de vasculaire structuur van axolotl te visualiseren of patronen van revascularisatie in regenererende weefsels te demonstreren.
Inleiding
Visualisatie van vasculatuur speelt een belangrijke rol bij het begrijpen van de structuur en functie van organismen in vele soorten. Vanaf de 16e eeuw met Leonardo da Vinci zijn modellen en grafische voorstellingen van de circulatie 1 bestudeerd. Met behulp van wassen en rubberen matrijzen werden weefsels geperfuseerd om driedimensionale modellen van de vaatwortel te creëren, die de studie van organogenese en pathogenese 1 , 2 toonden. Harsen en wassen werden gekleurd met kleurstoffen zoals India Ink of Carmine Red om hun eenvoudige visualisatie 1 , ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle axolotl-experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het Institutional Animal Care and Use Committee van Brigham en Women's Hospital (BWH).
1. Stel Perfusion Experiment op
- Plaats een volwassene axolotl in een plastic container, gevuld met 0,1% tricaine oplossing (MS222) gedurende 15-20 minuten of tot het volledig verdoofd is. Zorg ervoor dat de container voldoende tricineoplossing is, zodat de axolotl volledig ondergedompeld is.
Opmerking: Alle procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierlijke zorg. Bij BWH wordt een axolotl als volledig verdoofd beschouwd als het ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met DiI-kleuring kan de vasculatuur van de axolotl gemakkelijk worden visualiseerd. Bloedvaten van dieren geperfuseerd met de lipofiele kleurstof zijn direct zichtbaar onder een fluorescerende confocale microscoop. Figuur 1 .1-1.5 is een schematische weergave van het perfusieprotocol. Na perfusie met de helderroze kleurstof zal een succesvol geperforeerde axolotl roze verschijnen. Met behulp van een groen fluorescerend filter op een co.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Visualisatie van de vasculatuur van de axolotl kan succesvol worden bereikt via perfusie met de lipofiele carbocyanine kleurstof, DiI. In deze studie beschrijven we een nieuw protocol voor de perfusie van de axolotl met DiI met behulp van een peristaltische pomp. We tonen ook de latere visualisatie van de axolotl vasculatuur met behulp van een fluorescerende confocale microscoop. Dit protocol was een aanpassing van het knaagdier DiI perfusieprotocol gezien in Li et al. 7 , maar grote ver.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door het Brigham & Women's Hospital en de March of Dimes. De auteurs willen alle leden van het Whited Lab bedanken voor hun steun en advies.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusie slang | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | maat S1A |
| 27g vlindernaald | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Gedestilleerd water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Chirurgische pincetten | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyreen schuim frame | elke polystyreen schuim vierkant met een axolotl-vormige uitgesneden | ||
| Chirurgische schaar | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbeerbare onderlaag | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Papieren handdoeken | |||
| Standaard wegwerpoverdrachtspijp | Fisherbrand | 50216954 | |
| Klemstandaard | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine poeder |
| Volwassen axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Kunststof tanks | Variërende maat geschikt voor de axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscoop | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescerende Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
Referenties
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
