Aldersrelaterede sygdomme er forbundet med flere defekter i cytoplasmaets komponenter. Her præsenterer vi en protokol til fremstilling af plasmamembranvesikler fra knoglemarvs mesenkymale stamceller. Denne teknik kan potentielt anvendes som et middel til cytoplasmudskiftningsterapi til at forbedre eller endog omvendt aldersrelaterede fænotyper.
Vi har tidligere rapporteret om dannelsen af plasmamembresvesikler (PMV'er) gennem mekanisk ekstrudering af pattedyrceller. Fusionen af PMV'er med mitochondriale mangelfulde Rho0-celler genoprettede mitotisk aktivitet under normale dyrkningsbetingelser. Aterosklerose, type 2 diabetes, Alzheimers sygdom og kræft er aldersrelaterede sygdomme, der er rapporteret at være forbundet med flere mekaniske og funktionelle defekter i cytosol og organeller af en række celletyper. Knoglemarv mesenkymale stamceller (BMSC'er) repræsenterer en unik cellepopulation fra knoglemarven, som har selvfornyelsesevne, samtidig med at deres multipotensitet opretholdes. Suppleringen af senescensceller med ung cytoplasma fra autologe BMSC'er via fusion af PMV'er giver en lovende tilgang til forbedring eller endog omvendt aldersrelaterede fænotyper. Denne protokol beskriver, hvordan man forbereder PMV'er fra BMSC'er via ekstrudering gennem en polycarbonatmembran med 31; m porer, bestemme forekomsten af mitokondrier og undersøge vedligeholdelsen af membranpotentialet inden for PMV'er ved anvendelse af et konfokalt mikroskop, koncentrere PMV'er ved centrifugering og udføre in vivo injektionen af PMV'er i muskels gastrocnemius muskel.
En stor mængde indsats er blevet brugt til at etablere tilgange til gen-, enzym- og celleudskiftningsterapier. Dette har resulteret i store gennembrud og endda kliniske anvendelser 1 , 2 , 3 . For nylig blev en kontroversiel mitokondrierepoterterapi baseret på nukleoverførselsteknologi anvendt til in vitro befrugtning til kvinder i alderdommen eller med en dødelig mitokondriell DNA-mutation 4 . Defekter, der findes i aldersrelaterede sygdomme, herunder aterosklerose, type 2 diabetes, Alzheimers sygdom og kræft, er som regel mange facetter. Det er blevet dokumenteret, at akkumuleringen af lipiddråber; Aflejringen af amyloidprotein; Opbevaring af udfoldede proteiner i det endoplasmatiske retikulum; Og defekt proteasom, autophagosom og mitokondrier bidrager til udviklingen eller forværringen af disse sygdomme"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . I øjeblikket er der ingen tilgængelig mekanisme rettet mod direkte afhjælpning af funktionsfejl i cytosol og organeller, hvilket forårsager senescens og aldrende fænotyper.
Vi har tidligere rapporteret om dannelsen af plasmamembresvesikler (PMV'er) gennem den mekaniske ekstrudering af pattedyrceller 12 . Med undtagelse af kernen blev komponenter i membranen eller cytosolen, herunder proteiner og RNA, såvel som organellerne, såsom mitokondrier, fundet i PMV'er. I det væsentlige kan en PMV betragtes som en miniature enucleeret celle. Endnu vigtigere fik fusion af PMV'er med mitokondrier-defekte Rho0-celler genoprettet mitotisk aktivitet under normale dyrkningsbetingelser. Dette er den første rapport om establiUdvise en potentielt effektiv tilgang til cytoplasm-erstatningsterapi.
Knoglemarvs mesenkymale stamceller (BMSC'er) er multipotente stamceller, som rutinemæssigt genereres fra knoglemarven og ekspanderes let i kultur. Embryonale stamcelle markører Oct4, Nanog og SOX2 er blevet påvist ved lave niveauer i MSCs 13 . Telomeraseaktivitet er også målelig. Desuden gør fraværet af co-stimulerende molekyler og humane leukocytantigen (HLA) klasse II-molekyler såvel som lav HLA klasse I-ekspression på MSC'er dem ideelle celler til allogen eller "off-the-shelf" -brug i Både regenerativ medicin og immunmodulerende anvendelser 14 .
Her beskriver vi hvordan man forbereder PMV'er fra mus BMSC'er via ekstrudering gennem en polycarbonatmembran med 3 μm porer, bestemmer forekomsten af mitokondrier og undersøge vedligeholdelsen af membranpotentialet i PMV'er ved anvendelse af confocAl mikroskopi, forberede koncentrerede, men ikke aggregerede PMV'er ved centrifugering og udføre in vivo injektionen af PMV'er i muscus gastrocnemius muskelen.
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Li Ka Shing Foundation, Guangdong High Level University Project "Grønne Technologies for Marine Industries", Natural Sciences Foundation of China (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) og Education Department of Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |