Mesure de l&#39;absorption de glucose et réponse à la stimulation de l&#39;insuline dans<em&gt; In Vitro</em&gt; Myotubes primaires humains cultivés

Résumé

Dans cette méthode, les cellules musculaires primaires humaines sont cultivées in vitro pour obtenir des myotubes différenciés et les taux d'absorption du glucose sont mesurés. Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux dans les états basal et stimulés par l'insuline en utilisant du [ ³ H] 2-désoxy-D-Glucose radiomarqué.

Résumé

Le muscle squelettique est le plus grand dépôt de glucose chez les mammifères et contribue largement à l'homéostasie du glucose. L'évaluation de la sensibilité à l'insuline des cellules musculaires est d'une importance majeure pour toutes les études consacrées à l'exploration du métabolisme du glucose musculaire et à la caractérisation des altérations métaboliques. Dans les cellules musculaires, les protéines de transporteur de glucose de type 4 (GLUT4) se transposent vers la membrane plasmique en réponse à l'insuline, ce qui permet une entrée massive de glucose dans la cellule. La capacité des cellules musculaires à répondre à l'insuline en augmentant le taux d'absorption de glucose est l'une des lectures standard pour quantifier la sensibilité des cellules musculaires à l'insuline. Les myotubes primaires humains sont un modèle in vitro approprié, car les cellules conservent de nombreuses caractéristiques du phénotype du donneur, y compris la sensibilité à l'insuline. Ce modèle in vitro convient également pour le test de tout composé susceptible d'avoir une incidence sur la réactivité de l'insuline. Les mesures du taux d'absorption de glucose dans les myotubes différenciés reflètentSensibilité à l'insuline.

Dans cette méthode, les cellules musculaires primaires humaines sont cultivées in vitro pour obtenir des myotubes différenciés, et les taux d'absorption de glucose avec et sans stimulation par l'insuline sont mesurés. Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux de transport de glucose passifs et actifs en utilisant [ ³ H] 2-désoxy-D-Glucose ([ ³ H] 2dG radiomarqué [2H]. Des méthodes de calcul sont fournies pour quantifier les taux basiques actifs et stimulés par l'insuline, ainsi que le pli de stimulation.

Introduction

Le muscle squelettique est le plus grand dépôt de glucose chez les mammifères et contribue largement à l'homéostasie du glucose. Ce tissu sensible à l'insuline est le site principal de l'absorption de glucose qui est déclenchée par la stimulation de l'insuline ¹ .

Dans le diabète de type 2, la résistance à l'insuline est observée dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique, et conduit à une concentration de glucose sanguin supérieure à la normale. Ainsi, il est très important de déterminer le niveau de sensibilité à l'insuline de ce tissu et de ses cellules, qu'il s'agiss....

Protocole

1. Préparation des supports de culture cellulaire et des solutions

1. Préparation des milieux de culture
   1. Préparer le milieu de prolifération (PM) en complétant le milieu F-10 de jambon avec de la glutamine (2 mM), de la pénicilline / streptomycine (5 ug / ml de finale), 2% de sérum de veau fœtal (FCS) et 2% de substitut de sérum.
   2. Préparer le milieu de différenciation (DM) en complétant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec de la glutamine (2 mM), de la pénicilline / streptomycine (5 μg / mL) et 2% de FCS.
2. Préparation des solutions d'absorption du glucose
   Attention: l....

Résultats

Le jour 3, les myoblastes atteignent la confluence ( figure 1A ). Les myoblastes à ce stade sont typiquement mononucléés. Le moyen a été changé et, au jour 8, la différenciation a été complétée ( figure 1B ) (protocole section 2). Après 5 jours de différenciation, les myotubes sont alignés et typiquement polynucléés. Les myotubes primaires humains ont été soumis à un traitement par le palmitate ou un BSA uniquement avant la mesu.......

Discussion

L'absorption de glucose est une mesure biologique clé pour tester les activateurs ou les inhibiteurs de la culture cellulaire et leur impact sur l'utilisation du glucose et la capacité de la cellule à répondre à l'insuline. La méthode décrite ici s'est révélée rapide et fiable et a été largement utilisée dans de nombreuses études utilisant des myotubes primaires de sujets sains et / ou métaboliquement affectés ^{6 , 7 ,}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Préparation	maison à partir de biopsies des muscles squelettiques humains	Préparation maison à partir de biopsies des muscles squelettiques humains	Si elle n’est pas disponible, utilisez une source commerciale
Cellule musculaire primaire humaine	Promocell	C-12530	Doit être cultivée avec les milieux associés C23060 et C23061
Plaque à 6 puits	Corning	356400	BioCoat Collagen I Plaques
multipuitsHam’s F10	Dutscher	L0145-500	1 g/L de glucose
Glutamine	Dutscher	X0551-100
péniciline/streptomycine 100x	Thermo fisher scientific	15140122
Substitut de sérum UltroserG	Pall France	15950.017	substitut de sérum dans le texte
DMEM faible teneur en glucose	Dutscher	L0064-500	1 g/L de glucose
Sérum de veau fœtal	Eurobio	CVFSVF00-01
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Dutscher	L0625-500	Contient Mg2+ (0,5 mM) et Ca2+ (0,9 mM)
Solution d’insuline humaine	Sigma-Aldrich	I9278
2-désoxy-D-glucose  ;	Sigma-Aldrich	D6134
Albumine bovine	euromedex	04-100-812-E
sans acides gras BSA	Roche	10,775,835,001
palmitate	Sigma-Aldrich	P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]	PerkinElmer	NET328A001MC	Activité spécifique : 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasine B	Sigma-Aldrich	c2743
PICO PRIAS FLACON 6 mL	PerkinElmer	6000192
ultima gold MW CA  ;	PerkinElmer	6013159	liquide à scintillation
bê ; Compteur TA  ;	PerkinElmer	2900TR