Персонализированные иглы для микроинъекций в мозге, грызунов
Summary
Здесь мы описываем протокол для микроинъекции в грызунов мозга, которая использует иглы кварца. Эти иглы не производят повреждение обнаружено тканей и обеспечить надежную доставку даже в глубоких регионах. Кроме того они могут быть адаптированы к потребностям исследования, индивидуальный дизайн и может быть повторно использован.
Abstract
Микроинъекции были использованы для долгое время для доставки наркотиков или токсинов в областях конкретных мозга и, совсем недавно, они были использованы для доставки продукции терапии гена или ячейки. К сожалению, текущие микроинъекции методы используют стали или стекла иглы, которые субоптимальные для нескольких причин: в частности, стальные иглы может вызвать повреждение тканей, и стекла иглы могут согнуть когда глубоко опустил в мозг, пропавших без вести целевого региона. В этой статье мы опишем протокол готовить и использовать кварцевый иглы, которые сочетают в себе целый ряд полезных функций. Эти иглы не производят повреждение обнаружено тканей и, будучи очень жесткая, обеспечить надежную доставку в регионе желаемого мозг, даже при использовании глубокую координат. Кроме того это позволяет персонализировать дизайн иглы, сделав несколько отверстий диаметром желаемого. Несколько отверстий облегчить инъекций большого количества раствора в течение большей площади, тогда как большие отверстия облегчить инъекции клеток. Кроме того эти кварц иглы можно чистить и повторно используются, таким образом, что процедура становится экономически.
Introduction
Микроинъекции использовались долгое время для доставки фармакологически активных соединений для модуляции активности нейронов в областях конкретных мозга. Кроме того они были использованы придать токсинов рядом конкретных нейрональных популяций, чтобы имитировать нейродегенеративных события характеристика некоторых заболеваний, например 6-гидрокси допамина в системе допамина Нигростриарный для имитации болезни Паркинсона 1 , 2 или saporin IgG иммунотоксин 192 поражением холинергических системы3. Совсем недавно микроинъекции процедуры использовались для доставки вирусных векторов или клетки трансплантатов для ген или ячейки терапии экспериментального мозга расстройств4,5.
Классический тип иглы, используемые в этих исследованиях сделан из нержавеющей стали. Хотя легко и практично использовать, стальные иглы имеют ряд проблем6: они являются относительно большой и может вызвать повреждение тканей, с утечки blood – brain барьер и активации астроциты; Кроме того они могут производить кернов мозговой ткани, который попадает в иглу, создавая препятствие или даже полностью избежать потока желаемого решения. Совсем недавно стекло иглы, подготовленного специальной из капилляров были введены в использовать7,8. Они не вызывают существенных ткани ущерб ни экзоцитоз активации, но относительно гибким и может согнуть, когда введена в глубинных структур, уменьшение точность локализации (личных наблюдений).
Поэтому существует необходимость сократить столько, сколько возможный ущерб (особенно при выполнении экспериментов, чтобы залечить повреждения) при одновременном повышении точности и воспроизводимости (то есть, убедитесь, что все решения доставляется и обеспечения правильной локализации). Кроме того было бы желательно использовать иглы различных конструкций для обеспечения оптимального распределения раствора вводят в областях головного мозга с различной геометрией. В этой статье мы опишем протокол готовить и использовать кварцевый иглы для микроинъекций в мозге, грызунов. Из-за высокой точкой плавления кварцевые капилляры не может быть вытащил на обычных съемник и таким образом, не использовались в прошлом для создания иглы. Кварц, однако, предлагает некоторые важные преимущества по сравнению стекла, в частности высокая жесткость и разрыв сопротивление9. Из-за их жесткость кварц иглы идеально подходят для инъекции в брюшной части мозга. Из-за их высокой устойчивостью к поломке они могут быть смоделированы включить несколько отверстий, получение образцов, которые могут оказаться наиболее эффективными, даже при нацеливании на мозг регионов со сложной геометрией10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный в этой статье удовлетворяет потребности, изложенные в Введение для оптимизации микроинъекций, которые выполняются для различных целей12. Иглы, описанные здесь уменьшить урон минимум, практически не поддающихся обнаружению уровня; расходится с иг?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грант от Европейского сообщества [FP7-человек-2011-IAPP проекта 285827 (EPIXCHANGE)].
Materials
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
References
- Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
- Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
- Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
- Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
- Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
- Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
- Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
- Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
- Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
- Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
- Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).
