Personalisierte Nadeln für Mikroinjektionen im Nagetier Gehirn
Summary
Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Mikroinjektion im Nagetier Gehirn, das Quarz-Nadeln verwendet. Diese Nadeln nicht nachweisbar Gewebeschäden zu produzieren und zuverlässige Lieferung auch in tiefen Regionen zu gewährleisten. Darüber hinaus können sie Forschungsbedarf durch personifizierte Entwürfe angepasst und können wiederverwendet werden.
Abstract
Mikroinjektionen werden für eine lange Zeit für die Lieferung der Medikamente oder Giftstoffe in bestimmten Hirnarealen, und in jüngerer Zeit, sie wurden verwendet, um gen oder Zelle Therapie-Produkte zu liefern. Leider, aktuelle Mikroinjektion Techniken verwenden, Stahl oder Glas Nadeln, die aus mehreren Gründen suboptimal sind: insbesondere Stahl Nadeln können dazu führen, dass Gewebeschäden und Glas Nadeln können verbiegen, wenn tief ins Gehirn, senkte die Zielregion fehlt. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Quarz-Nadeln, die eine Reihe von nützlichen Funktionen kombinieren verwenden. Diese Nadeln produzieren keine nachweisbaren Gewebeschädigung und als sehr steif, zuverlässige Lieferung in die gewünschte Hirnregion zu gewährleisten, auch wenn Sie Tiefe Koordinaten verwenden. Darüber hinaus ist es möglich, das Design der Nadel zu personalisieren, indem man mehrere Löcher von den gewünschten Durchmesser. Mehrere Bohrungen erleichtern die Injektion von großen Mengen der Lösung innerhalb eines größeren Bereichs, während große Löcher die Injektion von Zellen erleichtern. Darüber hinaus können diese Quarz-Nadeln gereinigt und wiederverwendet, so dass das Verfahren kostengünstiger wird.
Introduction
Mikroinjektionen wurden für eine lange Zeit für die Lieferung von pharmakologisch wirksamen Verbindungen zur neuronalen Aktivität in bestimmten Hirnarealen zu modulieren. Darüber hinaus wurden sie zur Giftstoffe in der Nähe von bestimmten neuronalen Populationen, um Neurodegenerative Veranstaltungen charakteristisch für bestimmte Krankheiten, z. B. 6-hydroxy-Dopamin im Nigrostriatal Dopaminsystem der Parkinson-Krankheit zu imitieren zu imitieren injizieren 1 , 2 oder Immunotoxin 192 IgG Saporin, Läsion der cholinergen System3. Vor kurzem wurden Mikroinjektion Verfahren zur viralen Vektoren oder Zellen Transplantate für experimentelle Gehirn Störungen4,5gen oder Zelle Therapie liefern.
Die klassische Art der Nadeln, die in diesen Studien beschäftigt ist aus Edelstahl gefertigt. Obwohl einfach und praktisch in der Handhabung, Stahl Nadeln haben eine Reihe von Problemen6: sie sind relativ groß und kann dazu führen, dass Gewebeschäden, mit Austritt von Blut – Hirn-Schranke und Aktivierung der Astrozyten; Darüber hinaus können sie produzieren, Entkernung des Hirngewebes, die in die Nadel ein Hindernis oder sogar ganz vermeiden Strömung der gewünschten Lösung kommt. In jüngerer Zeit, verwenden Glas Nadeln bereit ad hoc aus Kapillaren wurden eingeführt in7,8. Diese verursachen keine signifikante Gewebe Schaden oder Astrozyten Aktivierung, aber sind relativ flexibel und können verbiegen als Tiefenstrukturen, reduziert die Genauigkeit der Lokalisierung (persönliche Beobachtungen) eingeführt.
Daher besteht die Notwendigkeit, so viel wie möglich Schaden zu reduzieren (vor allem bei Experimente, um Schaden zu heilen) und Erhöhung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit (d.h., sicherzustellen, dass alle Lösung geliefert wird und korrekte Lokalisierung zu gewährleisten). Darüber hinaus wäre es wünschenswert, verschiedenen Nadel Designs zu verwenden, zur Gewährleistung einer optimalen Verteilung der injizierten Lösung in Hirnarealen mit unterschiedlichen Geometrien. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll um vorzubereiten und Quarz Nadeln für Mikroinjektionen im Nagetier Gehirn. Aufgrund der hohen Schmelzpunkt Quarz Kapillaren können nicht auf einem herkömmlichen Abzieher gezogen werden und daher nicht verwendet wurden in der Vergangenheit, um Nadeln zu generieren. Quarz, bietet jedoch einige wichtige Vorteile gegenüber Glas, insbesondere eine hohe Steifigkeit und Pause Widerstand9. Infolge ihrer Unbeugsamkeit sind Quarz Nadeln geeignet für Injektionen in ventralen Hirnregionen. Durch ihre hohe Beständigkeit gegen Bruch können sie modelliert werden, um mehrere Löcher, Erlangung Designs, die am effektivsten erweisen, selbst wenn Gehirnregionen mit komplexen Geometrien10gezielt erweitert.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel beschriebene Verfahren erfüllt die Bedürfnisse dargelegt in der Einleitung zur Optimierung Mikroinjektionen, die für verschiedene Zwecke12ausgeführt werden. Die hier beschriebenen Nadeln reduzieren Schäden auf ein minimum, im Wesentlichen nicht detektierbare Niveau; an der Abweichung mit Glas-Nadeln (, die anfällig für biegen), Quarz-Nadeln sind starr und gewährleisten einen zuverlässige Hit von der gewünschten Hirnregion sogar in tiefen Koordinaten. Zu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus der Europäischen Gemeinschaft [RP7-Menschen-2011-IAPP Projekt 285827 (EPIXCHANGE)].
Materials
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
References
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