Personlig nåle til Microinjections i gnavere hjernen

Summary

Vi beskriver her en protokol for mikroinjektion i gnavere hjernen, der anvender kvarts nåle. Disse nåle ikke producere påviselige vævsskader og sikre en pålidelig levering selv i dyb regioner. Desuden, de kan tilpasses til forskningsbehov ved personlig designs og kan genbruges.

Abstract

Microinjections har været brugt i lang tid for levering af medicin eller giftstoffer inden for specifikke hjernen områder, og for nylig, de har været brugt til at levere genet eller cellen terapi produkter. Desværre, nuværende mikroinjektion teknikker bruger stål eller glas nåle, der er suboptimal af flere grunde: især stål nåle kan forårsage vævsskader, og glas nåle kan bøje når sænket dybt ind i hjernen, mangler målområde. I denne artikel vil beskrive vi en protokol for at forberede og bruge quartz nåle, der kombinerer en række nyttige funktioner. Disse nåle producerer ikke påviselige vævsskader, og bliver meget stiv, sikre en pålidelig levering i regionen ønskede hjerne selv når ved hjælp af dybe koordinater. Derudover er det muligt at tilpasse udformningen af nålen ved at lave flere huller i den ønskede diameter. Flere huller lette injektion af store mængder af løsning inden for et større område, store huller lette indsprøjtning af celler. Derudover kan disse kvarts nåle renses og genbruges, således at proceduren bliver omkostningseffektive.

Introduction

Microinjections har været brugt i lang tid for levering af farmakologisk aktive stoffer til at modulere neuronal aktivitet i specifikke hjernen områder. Desuden, har de været brugt til at injicere toksiner nær bestemt neuronal populationer, at efterligne neurodegenerative begivenheder karakteristisk for visse sygdomme, for eksempel 6-hydroxy-dopamin i nigrostriatal dopamin system til at efterligne Parkinsons sygdom ^{1 , 2} eller immunotoxin 192 IgG saporin til læsion kolinerge system³. For nylig, mikroinjektion procedurer har været brugt til at levere virale vektorer eller celler grafts for genet eller cellen terapi af eksperimentelle hjernen lidelser^4,5.

Den klassiske type af nåle ansat i disse undersøgelser er lavet af rustfrit stål. Selv om let og praktisk at bruge, stål nåle har en række problemer⁶: de er forholdsvis store og kan forårsage vævsskader, med udsivning af blod – hjerne barrieren og aktivering af astrocytter; Derudover kan de producere coring af hjernevæv, der får ind nål skabe en hindring eller endda helt at undgå strømmen af den ønskede løsning. Mere nylig, glas nåle rede ad hoc- fra kapillærer er blevet indført i bruge^7,8. Disse forårsage ikke betydelige væv skade eller astrocyte aktivering, men fleksible relativt og kan bøje da indført i dybe strukturer, at reducere nøjagtigheden af lokalisering (personlige observationer).

Der er derfor behov for at reducere så meget som muligt skader (især hvis du udfører eksperimenter for at helbrede skader) samtidig øge nøjagtigheden og reproducerbarhed (dvs.sikre, at alle løsning leveres og sikre korrekt lokalisering). Det ville desuden være ønskeligt at bruge forskellige nål designs til at sikre optimal fordeling af den injicerede løsning i hjernen områder med forskellige geometrier. I denne artikel vil beskrive vi en protokol for at forberede og bruge quartz nåle til microinjections i gnavere hjernen. På grund af den højt smeltepunkt, kvarts kapillærer kan ikke trækkes på en konventionel aftrækker og derfor har ikke været brugt i fortiden til at generere nåle. Kvarts, men tilbyder nogle vigtige fordele i forhold til glas, navnlig høj stivhed og break resistance⁹. På grund af deres stivhed, er kvarts nåle ideelt egnet til injektioner i ventrale hjerneregioner. På grund af deres høje modstandsdygtighed over for brud kan de modelleres til at omfatte flere huller, at opnå design, der kan vise sig mest effektive, selv når du målretter hjerneregioner med komplekse geometrier¹⁰.

Protocol

Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af universitetet i Ferrara etiske komité for animalsk eksperimenter og det italienske sundhedsministerium. KOMMER (Animal forskning: rapportering i Vivo forsøg11) retningslinjer er blevet fulgt. 1. forberedelse af kvarts nåle Rengøre og sterilisere kvarts kapillærer (Se Tabel af materialer) ved at placere dem i 5 min i destilleret vand, 5 min i ethanol 99% og 5 min i diethylether. F…

Representative Results

Vi sammenlignede skader induceret af direkte mikroinjektion i rotte dorsale hippocampus og striatum ved hjælp af et quartz nål (60 µM udvendig diameter tip, en 20 µM diameter side hul, type C, figur 1) sammenlignet med to klassiske, 26 G stump ende og 30 G facet kant rustfrit stål nåle. Til dette formål, vi injiceres 2 µL af aCSF i højre og venstre dorsale hippocampus og striatum ved hjælp af henholdsvis kvarts og stål nål og, 48 timer efter injek…

Discussion

Den teknik, der er beskrevet i denne artikel opfylder de behov, der er skitseret i introduktionen til at optimere microinjections, der udføres til forskellige formål¹². Nålene beskrevet her reducere skader til et minimum, hovedsagelig ikke-sporbare niveau; på varians med glas nåle, (der er tilbøjelige til at bøje), kvarts nåle er stive og sikre en pålidelig hit i regionen ønskede hjerne selv i dyb koordinater. Desuden sikrer side hul levering af løsningen selvom tip hul…

Materials

Quartz capillaries	Sutter Instruments, Novato, CA USA	Q100-50-10	Without filament
Puller	Sutter	P2000
Micropipette storage jar	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	E210
Laser microdissector	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	LMD6500
Hamilton syringe	Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany	19138-U
Microinfusion pump	Univentor, Zejtun, Malta	Model 864
Manual microinjection pump kit	WPI	Item#: MMP-KIT	Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame
Precision Drill	Proxxon	28510 MicroMot 50/E	Ball bearing drive shaft with variable speed
Artficial Cerebral Spinal Fluid	Tocris	3525
Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel	Hamilton	26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757
Microtome	Leica, Germany	LEICA RM212RT