Generering av genetiskt modifierade möss genom mikroinjektion av oocyter
Summary
Mikroinjektionen av musoocyter används vanligtvis för både klassisk transgenes ( dvs den slumpmässiga integrationen av transgener) och CRISPR-medierad geninriktning. Detta protokoll granskar den senaste utvecklingen inom mikroinjektion, med särskild tonvikt på kvalitetskontroll och genotypstrategier.
Abstract
Användningen av genetiskt modifierade möss har avsevärt bidragit till studier på både fysiologiska och patologiska in vivo- processer. Den pronukleära injektionen av DNA-expressionskonstruktioner i befruktade oocyter är den vanligaste tekniken för att generera transgena möss för överuttryck. Med införandet av CRISPR-teknik för geninriktning har pronukleär injektion i befruktade oocyter utvidgats till alstring av både knockout- och knock-möss. I detta arbete beskrivs förberedelsen av DNA för injektion och generering av CRISPR-guider för genriktning, med särskild tonvikt på kvalitetskontroll. Genotypförfarandena som krävs för identifiering av potentiella grundare är kritiska. Innovativa genotypstrategier som utnyttjar "Multiplexing" -funktionerna i CRISPR presenteras här. Kirurgiska procedurer beskrivs också. Tillsammans kommer protokollets steg att möjliggöra generering av genEtiskt modifierade möss och för efterföljande etablering av muskolonier för en uppsjö av forskningsfält, inklusive immunologi, neurovetenskap, cancer, fysiologi, utveckling och andra.
Introduction
Djurmodeller, både hos ryggradsdjur och ryggradslösa djur, har varit avgörande för att undersöka patofysiologin hos mänskliga tillstånd, såsom Alzheimers sjukdom 1 , 2 . De är också ovärderliga verktyg för att söka sjukdomsmodifierare och till sist utveckla nya behandlingsstrategier i hopp om ett botemedel. Även om varje modell har inneboende begränsningar är användningen av djur som hela systemiska modeller avgörande för biomedicinsk forskning. Detta beror på att den metaboliska och komplexa fysiologiska miljön inte helt kan simuleras i vävnadsodling.
Hittills är musen den vanligaste däggdjursarter som används för genetisk manipulation eftersom det har flera fördelar. De fysiologiska processerna och generna som är associerade med sjukdomar är starkt konserverade mellan möss och människor. Musen var det första däggdjuret som hade sitt fulla genom sekvenserade (2002), ett år före det mänskliga genotMig (2003). Bortsett från denna rikedom av genetisk information har musen god avelsförmåga, en snabb utvecklingscykel (6 veckor från befruktning till avvänjning) och en rimlig storlek. Alla dessa fördelar, i kombination med fysiologiska indikatorer, som tydliga färgfärger (krävs för övergångsstrategier) gjorde musen till en attraktiv modell för genetisk manipulation. I början av modern genetik började Gregor Mendel arbeta på möss innan han flyttade till växter 3 .
Genöverföringsteknik resulterade i genereringen av den första transgena musen över tre decennier sedan 4 , som ursprungligen skapades med hjälp av viral leverans. Forskare insåg emellertid snart att en av de viktigaste utmaningarna med mustransgenes var oförmågan att kontrollera ödet hos det exogena DNA. Eftersom den virala tillförseln av transgener i musokocyter resulterade i flera kopior som slumpmässigt integrerades i genomet, var möjlighetenY för att etablera efterföljande transgena linjer var begränsade.
En sådan begränsning övervinnades när Gordon et al. Genererade den första transgena muslinjen genom mikroinjektion 5 , 6 . Detta började epoken med rekombinant DNA-teknik, och parametrarna som påverkar resultatet av en mikroinjektionssession har studerats omfattande 7 . Även om mikroinjektion inte tillåter kontroll över transgenets integrationsplats (vilket slutligen resulterar i specifika uttrycksnivåer för varje grundmus), förblir den huvudsakliga fördelen med pronukleär mikroinjektion bildandet av concatemers ( dvs arrays av multipla kopior av transgenet, Kopplade i serie) före genomisk integration 5 . Denna egenskap har använts under åren för att etablera tusentals transgena muslinjer som överuttrycker en gen av intresse. Sedan dess har transgenes, aArtificiell modifiering av en organisms genom har i stor utsträckning använts för att identifiera rollen av enskilda gener i förekomsten av sjukdomar.
En ytterligare nyckelprestation för att manipulera musgenometet uppnåddes när Mario Capecchi framgångsrikt störde en enda gen i musen och öppnade genen för geninriktning 8 . Emellertid uppstod stora nackdelar snabbt från ES-cellbaserad geninriktning, inklusive utmaningarna att odla ES-celler, den något variabla graden av chimerism och processens längd ( dvs. 12-18 månader, minsta för att få musen) .
Nyligen har framsteg inom ny teknik, såsom manipulerade endonukleaser ( t.ex. zinkfingernukleaser (ZFN), transkriptionsaktivatorliknande effektornukleaser (TALEN) och klyvda regelbundna interspaced korta palindroma upprepningar (CRISPR / Cas9)) framkommit som alternativa metoder för att Påskynda processen med geninriktning i mikrofonE 9 , 10 . Dessa endonukleaser kan lätt injiceras i mus-oocyter genom mikroinjektion, vilket möjliggör generering av genriktade möss på så lite som 6 veckor.
Sedan den första rapporten om användningen av CRISPR för genomredigering 11 har detta bakteriellt adaptiva immunsystem ersatts ZFN och TALEN på grund av dess många fördelar, inklusive enkelheten i syntesen och förmågan att rikta flera loci på en gång (kallad multiplexering "). CRISPR användes först för geninriktning hos möss 12 och har sedan tillämpats på oräkneliga arter, från växter till människor 13 , 14 . Hittills finns det ingen rapport om en enda art som är resistent mot CRISPR genom redigering.
De två huvudbegränsande stegen i generationen av transgena möss är injektionen av oocyter och reimplantationenAv dessa oocyter till pseudo-gravida kvinnor. Fastän denna teknik har beskrivits av oss 15 och andra 16 har senaste tekniska förbättringar i musembryologi och genöverföringstekniker revolutionerat processen för att generera genetiskt modifierade möss. Dessa förbättringar kommer att beskrivas häri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg inom protokollet
Genereringen av genetiskt modifierade möss är känt att vara tekniskt utmanande. Protokollet som presenteras här är dock en optimerad och förenklad metod som gör att man kan behärska och felsöka tekniken i rekordtid. Det finns två steg som krävs för att tekniken ska kunna slutföras. För det första kan syntesen av linjära DNA-mallar (för syntesen av sgRNA) uppnås utan magnesiumklorid (MgCl2). Det är emellertid starkt rekommenderat att systematiskt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar personalen hos djuranläggningen (BRC) för deras pågående stöd. Detta arbete finansierades av National Health and Medical Research Council och Australian Research Council.
Materials
| Micropipette 0.1-2.5 ul | Eppendorf | 4920000016 | |
| Micropipette 2-20 ul | Eppendorf | 4920000040 | |
| Micropipette 20-200 ul | Eppendorf | 4920000067 | |
| Micropipette 100-1000 ul | Eppendorf | 4920000083 | |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1kb |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x – Dilute to 1x |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| PCR purification kit (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| Vacuum system (Manifold) | Promega | A7231 | |
| Nuclease-free microinjection buffer | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC microcentrifuge filter | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR expressing plasmid (px330) | Addgene | 42230 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA purification spin columns (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| Donor plasmid | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa embryo culture medium | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| Mineral oil | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Mouthpiece | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Glass microcapillaries | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Proteinase K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Vessel clamp | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| Wound clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Clips applier | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 incubator | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| Electrophoresis set up | BioRad | 1640300 | |
| UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| 2x Micromanipulators | Eppendorf | 5188000.012 | |
| Oocytes manipulator | Eppendorf | 5176000.025 | |
| Microinjector (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| Mice C57BL/6J strain | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
References
- Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer’s disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
- Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer’s mice. Science. 354 (6314), 904-908 (2016).
- Marantz Henig, R. . The Monk in the Garden. , (2000).
- Jaenisch, R., Mintz, B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).
- Carbery, I. D. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186 (2), 451-459 (2010).
- Sung, Y. H. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).
- Jinek, M. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wang, H. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kang, X. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).
- Liang, P. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).
- Ittner, L. M., Götz, J. Pronuclear injection for the production of transgenic mice. Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- . Resuspension Calculator Available from: https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/ (2017)
- Auerbach, A. B. Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production. Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).
- Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months. Biol Reprod. 86 (2), 49 (2012).
- Nakagawa, Y., et al. Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice. Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).
- Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 29 (17), E88 (2001).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nat Commun. 7, 10431 (2016).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. , (2016).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Liu, X., et al. A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling. J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).
- Ke, Y. D. Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS. Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).
- Auerbach, A. B. Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection. Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Zhou, Y. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum. Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).
- Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection. Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).
- Biggers, J. D., Summers, M. C. Choosing a culture medium: making informed choices. Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).
- Nakagata, N. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).
- Truett, G. E. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
- Delerue, F., Ittner, L. M. Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects. Clon. Transgen. 4, (2015).
