כימות צפיפות הענף בבלוטת החלב עכברוש- mounts כולו באמצעות שיטת ניתוח Sholl
Summary
התפתחות בלוטת החלב במכרסם הוערכה בדרך כלל באמצעות הערכות תיאוריות או על ידי מדידת תכונות פיזיות בסיסיות. צפיפות הענף היא אינדיקטור להתפתחות החלב שקשה לכמת באופן אובייקטיבי. פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להערכת כמותית של מאפייני הבלוטות החלב.
Abstract
מספר גדל והולך של מחקרים מנצלים את בלוטת החלב המכרעת כנקודת קצה להערכת הרעילות ההתפתחותית של חשיפה כימית. ההשפעות האלה חשיפות יש על התפתחות בלוטת החלב מוערכים בדרך כלל באמצעות מדידות ממדי בסיסי או על ידי ניקוד מאפיינים מורפולוגיים. עם זאת, טווח רחב של שיטות לפרש שינויים התפתחותיים עלול להוביל לתרגומים לא עקביים על פני מעבדות. יש צורך בשיטת הערכה מקובלת, כדי שיוכלו להיווצר פרשנויות מתאימות ממידע שנאסף על פני מחקרים. המחקר הנוכחי מתאר את היישום של שיטת ניתוח Sholl כדי לכמת מאפיינים הסתעפות בלוטת החלב. שיטת Sholl פותחה במקור לשימוש בכימות דפוסי דנדריטים נוירונים. באמצעות ImageJ, קוד פתוח תמונה ניתוח חבילת תוכנה, וכן תוסף שפותח עבור ניתוח זה, בלוטת החלב צפיפות צפיפות המורכבות של AMבלוטת החלב מתוך חולדה נקבה peripubertal נקבעו. השיטות המתוארות כאן יאפשרו את השימוש בניתוח Sholl ככלי יעיל לכימות מאפיין חשוב של התפתחות בלוטת החלב.
Introduction
בלוטת החלב הסתעפות היא מאפיין זה הוא בדרך כלל מוערך כמו אינדיקטור של התפתחות בלוטות, אבל קשה לכמת אובייקטיבי. בשנת 1953, Sholl 1 תיאר שיטה למדידת arborization דנדריטים נוירונים בקורטקס החזותי והמנועי של החתול, ותוסף עבור טכניקה זו פותחה על ידי Ferriera et al 2 . בגלל שני נוירונים בלוטות החלב התערוכה מבנה דומה עץ דמוי, תוסף הועסק לכמת צפיפות הסתעפות האפיתל השד בתמונות 2D של בלוטת החלב peripubertal חולדה. השלב peripubertal נבחר לניתוח בגלל הגמילה היא שלב החיים, כי הוא מוערך לעתים קרובות במעבדות אקדמיות ומבחני מבחן המבחן. ניתוח Sholl הוא תוסף מופץ עם FIJI, המהווה את קוד פתוח עיבוד תמונה ImageJJ, עם תוספים נוספים כלולים. התוסף יוצר סדרה של טבעות קונצנטריות המקיפות פרדף(בדרך כלל סומה של נוירון או המקור של צינור הראשי של בלוטת החלב) והרחבת החוצה לחלק דיסטלי ביותר של האובייקט (רדיוס מצרף). לאחר מכן הוא סופר את מספר הצמתים (N) המתרחשים בכל אחת מהטבעות. תוסף גם מחזירה מקדם רגרסיה Sholl ( k ), המהווה מדידה של קצב ריקבון הסתעפות אפיתל.
באמצעות ImageJ, תמונה skeletized של בלוטת החלב כולו הר נוצר ואזור אפיתל החלב (MEA) נמדדת. התמונה מנותחת באמצעות תוסף ניתוח Sholl, וערכים עבור N ו- k , בין ערכים אחרים שאינם מנוצלים כאן, מוחזרים. צפיפות הסתעפות אפיתל החלב נקבעת על ידי חישוב N / MEA. המידה שבה הסתעפות נמשכת באזורים החיצוניים של האפיתל הבלוטתי הוא המורכבות הסתעפות והוא אינדיקטור לצמיחה אפיתלית אחידה דיסטלי. כמו k הוא מדד של ירידה דיסטלית epithאלירי הסתעפות, הוא מדד יעיל של המורכבות הסתעפות אינדיקטור אמין של התפתחות החלב.
פרוטוקול זה מתאר שיטה בסיוע מחשב ליצירת תמונות skeletized של בלוטות החלב כולו mounts ו הערכה כמותית המאפיינים הסתעפות החלב ב עכברים peripubertal זכר ונקבה. שיטה זו מהירה יחסית ואינה דורשת שימוש בציוד מיקרוסקופי מיוחד. פיתוח ואישור של שיטה זו מתוארים Stanko et al. (2015) 3 . דוח זה מתאר גם הכנה של בלוטת החלב כולו = mounts. הליכים דומים של כל ההר-חזה תוארו ב- Assis et al. (2010) 4 ו Plante et al. (2011) 5 .
Protocol
Representative Results
Discussion
מלידה עד גיל ההתבגרות, הצמיחה בלוטת החלב היא allometric. לאחר גיל ההתבגרות, בלוטת החלב מתפתחת דרך הסתעפות הדוקטריים התארכות, אשר ממשיכים עד אפיתל החלב תופסת את כרית שומן כולו. מאפייני הסניף הם היבט חשוב של התפתחות בלוטת החלב, והיכולת לאמוד באופן אובייקטיבי מאפיינים אלה יכ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר מיכאל אסטרלינג (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) על עזרתו עם אימות השיטה הזאת וד"ר טיאגו פריירה (אוניברסיטת מקגיל, מונטריאול, קוויבק, קנדה) סיוע עם יישום Sholl.
Materials
| Dissecting board | NA | NA | A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable. |
| Dissecting T-Pins | Daigger | EF7419A | |
| Spray bottle with ethanol | NA | NA | 70% ethanol is suitable. |
| Curved dissecting scissors | Fine Science Tools | 14569-09 | |
| Straight dissecing scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001 | Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm | Fisher scientific | 12-548-5P | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (GC) | Sigma-Aldrich | 24102 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15 | |
| Macroscope | Leica | Z16 APO | This is the image capturing hardware and software used in this laboratory. As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories. |
| Digital camera | Leica | DFC295 | |
| Camera software | Leica | Leica Application Suite v3.1 | |
| ImageJ software | Open source | http://imagej.net/Welcome | |
| Sholl analysis | Open source | http://imagej.net/Sholl_Analysis |
References
- Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
- Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
- Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012)
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
- Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
- Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
- Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
- Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
- Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
- Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).
