Sektion Mammary Gland Whole Mounts för Lesion Identification
Summary
Vi utvecklade en metod för att framgångsrikt avlägsna, bearbeta, avbilda och fläcka, för histopatologisk utvärdering, bröstvävnad som ursprungligen hade fixerats på glidbanor som hela fästen. Den här metoden kan främja insamling och utvärdering av bröstkörtelns hela fästen i studier om reproduktiv och utvecklingstest.
Abstract
Normal utveckling av bröstkörteln kan förändras genom exponering för miljöstiftmedel och läkemedel, överdriven exponering för hormoner och genetiska förändringar. Mammary körtel hela fästen är en billig metod för att fånga utvecklingen av morfologiska förändringar som kan uppstå efter exponering. Men i senare liv, när abnormiteter är mer benägna att utvecklas, kan ensam beroende av den här metoden inte alltid ge tillräcklig information för att göra en korrekt diagnos av avvikelsen. Historiskt sett avlägsnas en enda bröstkörtel vid studier av kemiska testriktlinjer vid nekropsyra och prepareras som en hematoxylin och eosin (H & E) -färgad sektion. Införlivandet av kontralaterala bröstkollektion och analys av bröstmonteringar minskar sannolikheten för en falsk-negativ bedömning. Utvärderingen av hela berget är begränsad av närvaron av en eller två hela bröstkörtlar på en glid, och i vissa fall är de abnormiteter som observeras i hela berget ingenT enhetligt representerad i H & E-sektionen. Målet med denna studie var att utveckla ett protokoll för omvandling av täckläckade bröstmassor till H & E-färgade sektioner så att lesioner som annars skulle ha missat eller som är svåra att diagnostisera kan identifieras. Här beskriver vi en metod för att producera en högkvalitativ, paraffininkonstruerad H & E-sektion från en bröstkörtel som ursprungligen var förberedd som ett helmonterat. I jämförelse med en vävnad som avsiktligt förbereddes för H & E-sektion, kräver hela berget ytterligare förberedelse för borttagning och behandling av vävnad. Denna metod anses emellertid billigt, eftersom det kräver vanliga labreagenser och lite extra tid. Som ett resultat kan denna metod ge ovärderlig information om hur kemiska och miljömässiga exponeringar förändrar normal bröstutveckling, samt visar förändringar som uppstår på grund av genetiska modifieringar.
Introduction
Mammabrocket är en användbar och billig metod som implementeras i många rått- och musstudier för att förstå både normal och kemiskt inducerad, onormal utveckling. I allmänhet uppvisar en bröstkörtel i olika steg under utveckling av gnagare ( dvs. ungdomar, puberteten, mellan- till sen-gestation och involutionfasen) morfologiska förändringar i vävnad och cellulär arkitektur påverkad av parakrina, endokrina och autokrina faktorer 1 . I den åldrande råttan blir epitel- och strompartierna av körteln alltmer tät, vilket gör mätning av morfologiska parametrar svåra i ett helt berg. Således är det vanligt att samla en körtel för histologisk utvärdering för att identifiera förändringar på en mikroskopisk nivå. Båda processerna är särskilt användbara i studier som inbegriper kemisk exponering ( dvs. miljö- eller farmaceutisk) eller att undersöka de morfologiska förändringarna tillsammans med genetisk förändringations.
Tekniker och förmåga att använda bröstkörteln i riskbedömning fortsätter att utvecklas. Medan helmonterad förberedelse är rutinmässig och standardiserad, fortsätter modifieringen av snittning 2 , 3 . Många forskargrupper från olika bakgrunder ( dvs. akademi, regering och industri) har anpassat koronal / longitudinella delar av bröstvävnad som en föredragen metod, medan vissa laboratorier fortfarande använder tvärsnitt genom huden 4 . Den senare metoden resulterar i en överdriven representation av epidermis (hud), snarare än vävnad av intresse: bröstkörtelepitelet 2 . Koronala eller longitudinella sektioner är mer användbara för karakterisering av normal vävnad 5 och förbättrar avsevärt detekteringen av abnormiteter och lesioner på grund av den ökade ytarean och antalet strukturer som är närvarande. Sammantaget gör det hela moInte en lämplig metod för den jämförande histopatologiska bedömningen av bröstkörteln 1 , 2 . Om man använder en mus eller en råtta, hämtning och bevarande av den 4: e och femte ingreppskörteln rekommenderas starkt för jämförelsen av hela fästet till en kontralateral H & E-sektion.
När de används i kombination, ger H & E-sektionen och hela monteringen ett korrekt redogörelse för cell- och morfologiska förändringar som orsakas av miljöexponering. Detta är särskilt sant i vissa gnagare stammar där modellen har en låg mottaglighet för tumörbildning eller en tumör inte är grovt synlig. Under vissa omständigheter är det inte alltid möjligt att erhålla den erforderliga vävnaden med båda teknikerna ( dvs. otillräcklig vävnadsmängd, resurser eller oväntade experimentella resultat). I vårt fall observerades abnormiteter i bröstmassan, medan histopathoLogiska fynd i den kontralaterala H & E-körteln var vanligen normala. Den överväldigande skillnaden mellan de kontralaterala körtlarna ledde oss till att utveckla ett ekonomiskt och effektivt förfarande för att identifiera avvikelserna i hela fästena. Med användning av ett modifierat förädlings- och inbäddningsförfarande framställdes högkvalitativa H & E-färgade sektioner från paraffininkopplade helmonteringar. Vi ser det här protokollet som ett kraftfullt upptäcktverktyg för kemiska exponeringseffekter, vilket förbättrar jämförelser mellan laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bröstkörteln hel mount är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att illustrera den normala bröstutvecklingen och morfologiska förändringar som kan uppstå och kvarstår efter exponering för kemikalier, inklusive hormonförstörande medel. När en helmonterad och H & E-sektion från samma djur utvärderas tillsammans kan de ge en korrekt visuell ögonblicksbild av tidiga förändringar som kan utvecklas till ett mer sjukt tillstånd.
Förmågan att erhålla denna användbar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna skulle vilja bekräfta Pam Ovwigho, Tenette Jones och Natasha Clayton, NIEHS, för deras tekniska expertis och stöd med detta projekt.
Materials
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
References
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).
- Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. , (2017).
- Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).
- Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).
- Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).
- Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).
- Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).
