Let Manipulation af arkitekturer i Protein-baseret Hydrogels til celle kultur applikationer
Summary
Forskellige metoder til at manipulere tredimensionalt arkitektur i protein-baserede hydrogels evalueres her med hensyn til materialeegenskaber. Kombineret makroporøs netværk er functionalized med en celle-klæbende peptid, og deres gennemførlighed i cellekultur evalueres ved hjælp af to forskellige model cellelinjer.
Abstract
Hydrogels er anerkendt som lovende materialer til celle kultur ansøgninger på grund af deres evne til at yde meget hydreret celle miljøer. Inden for 3D skabeloner stigende på grund af den potentielle ligheden af disse materialer til de naturlige ekstracellulære matrix. Protein-baserede hydrogels er særligt lovende, fordi de let kan blive functionalized og kan opnå definerede strukturer med justerbar fysisk-kemiske egenskaber. Men produktion af kombineret makroporøs 3D skabeloner til celle kultur applikationer ved hjælp af naturlige materialer er ofte begrænset af deres svagere mekaniske egenskaber i forhold til de af syntetiske materialer. Her, forskellige metoder blev evalueret for at producere kombineret makroporøs bovint serumalbumin (BSA)-baserede hydrogel systemer, med justerbar pore størrelser i rækken af 10-70 µm i radius. Derudover blev en metode til at generere kanaler i dette protein-baseret materiale, der er flere hundrede mikron lange etableret. De forskellige metoder til at producere porer samt påvirkning af porestørrelse materialeegenskaber såsom hævelse ratio, pH, temperatur stabilitet og Enzymatisk nedbrydning adfærd, blev analyseret. Pore størrelser blev undersøgt i den indfødte, hævede tilstand af hydrogels ved hjælp af Konfokal laser scanning mikroskopi. Muligheden for celle kultur programmer blev evalueret ved hjælp af en celle-klæbende M.H.T. peptid ændring af ordningen for protein og to model cellelinjer: humane brystkræftceller (A549) og adenocarcinomic menneskelige alveolær basal epitelceller (MCF7).
Introduction
Hydrogels er materialer, der danner uopløselige 3D netværk habil bindende store mængder vand. Sådanne materialer kan give gode miljømæssige betingelser for levende celler. I øjeblikket, der stigende interesse i generation af tre-dimensionelle hydrogel strukturer og i udvikling af processer til at skræddersy deres kemiske og fysiske egenskaber. Når dette er opnået, kan en skabelon for væksten af celler og manipulation af cellulære adfærd være genereret1,2,3,4. Disse 3D strukturer ikke kun skaber en mere naturlig og realistisk miljø end konventionelle to-dimensionelle tilgange, men de også afslører nye muligheder for vækst af stamceller eller tumor modeller5. Forskellige materialer har en række karakteristika, der hovedsagelig afhænger af porestørrelse gel6. Porerne spiller en afgørende rolle i celle kultur applikationer, vævsmanipulering og den styret vækst af stamceller. For eksempel, ilt og næringsstoffer diffuse gennem matrixen, og tilstrækkelige mængder skal kunne nå celler7. På den anden side skadelige metabolitter skal fjernes så hurtigt som muligt, og tilstrækkelig plads til cellevækst skal være tilgængelig7. Derfor påvirke egenskaber af materialet, og dermed porestørrelse, alvorligt de potentielle fordele og mulige anvendelser af matrixen. Afhængig af materialets egenskaber, kan forskellige cellevækst processer forekomme i 3D cellekultur, herunder dannelsen af neuronal strukturer; vækst og differentiering af huden eller knogle celler; og styret væksten af særlige stamcellelinjer, som hepatocytter eller fibroblaster2,3,8,9,10,11. Et andet afgørende punkt påvirke en eventuel anvendelse af et materiale, er dens stabilitet mod eksterne stimuli12. For eksempel, skal hydrogel opretholde dens mekaniske integritet i celle Kulturmedier eller den menneskelige krop.
I de seneste år, forskning på 3D celle kultur hydrogels intensiveres, og mange undersøgelser blev udført for at løse de 3D arkitekturer systemer13. Hydrogels består af kemisk syntetiseret komponenter er hyppigst undersøgt, fordi de kan nemt syntetiseret og kemisk modificerede og de udviser høj stabilitet (Se Zhu et al., 2011 for en anmeldelse)5. Proteiner har dog mange gavnlige egenskaber: som såkaldte “præcision polymerer,” de er biokompatible; de har en defineret længde; de er forholdsvis nemme at ændre; og de har et stort antal mål websteder14,15. I denne forbindelse kan meget specifikke, nyskabende strukturer genereres til anvendelse inden for mange områder. I denne undersøgelse, blev en protein-baseret hydrogel16 brugt til at påvise veletablerede metoder evne til at påvirke den 3D arkitektur af materialet. Derudover blev kapacitet og anvendelighed til pore generation også undersøgt.
Mange forskellige teknikker er til rådighed til at ændre 3D strukturer, herunder både enkle metoder og sofistikeret, højt specialiserede teknikker fra forskellige områder af materiallære. En udbredt teknik er brugen af electrospinning til at generere veldefinerede strukturer17. Ladede fibre er trukket fra en løsning af et elektrisk felt og derefter størkne ved udsættelse for ilt. På denne måde kan blive produceret fibre i rækken af adskillige nanometer op til flere mikron. Supplerende teknikker til at tune størrelse, struktur og fordeling af porer i matrixen er bløde litografi, fotolitografi, hydrodynamiske fokusering, electro-sprøjtning, og bio-udskrivning18,19,20. En væsentlig ulempe af disse teknikker er deres afhængighed på specifikke, dyrt udstyr og specielle kemikalier eller materialer. Desuden erfaring med disse teknikker er ofte ikke direkte overføres til materialer baseret på protein, og mange af kemikalier og metoder er ikke celle kompatibel.
På den anden side stole mange teknikker ikke på specialudstyr, hvilket gør dem lettere og billigere at anvende og til at reproducere. En udbredt metode til struktur manipulation er solvent støbning21,22,23. Partikler er tilføjet før polymerisation reaktion og distribueres homogen måde for at mætte løsningen. Efter polymerisering medfører en ændring af betingelser, såsom en fortynding eller en ændring i pH, solvation af partiklerne, medens porerne i materialet. Kemikalier, der anvendes i disse teknikker, såsom salt, sukker, paraffin, gelatine og kridt, er billige og let tilgængelige. I frysetørring, er hævede hydrogels frosset. Den efterfølgende sublimering af flydende faser under en vakuum er derefter udført23,24,25. Vand sublimation fra netværket er blide nok til at opretholde de specifikke 3D strukturer af materialet. I gas skummende, der en løsning streames med en gas mens polymerisation finder sted, forlader porerne i gelen21. Størrelse og fordeling af porer kan justeres afhængigt af gasstrømmen.
For at danne protein hydrogel, reagerede BSA med tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium chlorid (THPC) i en Mannich-type reaktion at muliggøre dannelsen af kovalente bindinger mellem primære aminer og hydroxy grupper af fire bevæbnede linker molekyle26. Mulige skadelige mellemprodukter er fjernet af overdreven vask af materialet efter reaktionen opstår.
Denne undersøgelse viser muligheden for behandling af en BSA-baseret materiale med forskellige teknikker til at manipulere og tilpasse størrelsen af porerne. Hver af teknikkerne, der kan bruges i ethvert laboratorium på verdensplan, som ingen særlige udstyr er nødvendig. Derudover respekt forskellige parametre, såsom hævelse ratio, enzymatisk nedbrydelighed, pH stabilitet og temperatur følsomhed, er undersøgt og sammenlignet med hinanden, især for indflydelse fra de forskellige teknikker på generation af 3D arkitekturer. Endelig, materialerne blev functionalized med celle-klæbende peptider til at undersøge den mulige anvendelse af materialer til cellekultur. To forskellige model cellelinjer blev anvendt: A549 og MCF7.
Protocol
Representative Results
Discussion
The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Baden-Württemberg Stiftung for deres finansielle støtte i forbindelse med “Bioinspired materiale syntese” (BioMatS-14).
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) | Life Technologies / Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies / Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies / Thermo Fisher | 15140122 | |
| MEM Nonessential Amino Acid Solution | Sigma Aldrich | M7145-100ML | |
| Trypsin EDTA 0.05 % Phenol Red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Ölfabrik Schmidt | 2133 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| Albumin Fraction V | Carl Roth | 3854.2 | |
| THPC | Sigma Aldrich | 404861-100ML | Toxic |
| 0.1 % Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Slightly toxic |
| Phalloidin-rhodamine | Life Technologies / Thermo Fisher | R415 | |
| 3.7 % Formaldehyde | Life Technologies / Thermo Fisher | F8775-25ML | Toxic |
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | 81-88-9 | |
| Filtropur S 0.2, | Sarsted Ag und Co. | 2 83.1826.001 | |
| µ slide 8 well | Ibidi GmbH | 80826 | |
| KCSSGKSRGDS peptide | UPEP Ulm | Custom sysnthesis | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Carl Roth | K928.5 | |
| Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 50 ml | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 1,5 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,690,001 | |
| Tubes 2 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,691 | |
| CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM | Greiner | 655073 | |
| FreezeDryer Epsilon 1-6D, | Christ, Osterode am Harz, Germany | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 | GSA GmbH |
References
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
- Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
- Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
- Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
- Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
- Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
- Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
- Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
- Chiu, Y. -. C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
- Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
- Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker’s yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
- Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
- Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
- Selimović, &. #. 3. 5. 2. ;., Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
- Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
- Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
- Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
- Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
- Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
- Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
- Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
- Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
- Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices–Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
- Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
- Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).
