Tumorbehandlingsfelter (TTFields) er en effektiv antitumorbehandlingsmodalitet leveret via den kontinuerlige, ikke-invasive anvendelse af lavintensitets-, mellemfrekvens-, vekslende elektriske felter. TTFields applikation til cellelinjer ved anvendelse af et TTFields in vitro applikationssystem gør det muligt at bestemme den optimale frekvens, der fører til den højeste reduktion i celletællinger.
Tumorbehandlingsfelter (TTFields) er en effektiv behandlingsmodalitet leveret via den kontinuerlige, ikke-invasive anvendelse af lavintensitet (1-3 V / cm), vekslende elektriske felter i frekvensområdet på flere hundrede kHz. Undersøgelsen af TTFields i vævskultur udføres ved anvendelse af TTFields in vitro applikationssystem, som muliggør anvendelse af elektriske felter med varierende frekvenser og intensiteter til keramiske petriskåle med en høj dielektrisk konstant (Ɛ> 5000). Kræftcellelinjer udpladet på dækglas nederst på de keramiske petriskåle underkastes TTFields leveret i to ortogonale retninger ved forskellige frekvenser for at lette behandlingsafprøvningstests, såsom celletællinger og klonogene analyser. Resultaterne præsenteret i denne rapport viser, at den optimale frekvens af TTFields med hensyn til både celletællinger og klonogene analyser er 200 kHz for både æggestokke og gliomaceller.
Tumorbehandlingsfelter (TTFields) er en anti-mitotisk modalitet til behandling af glioblastom multiforme og potentielt andre kræftformer. Feltene leveres via kontinuerlig anvendelse af lavintensitet (1-3 V / cm), mellemfrekvens (100-500 kHz), vekslende elektriske felter til tumorområdet 1 , 2 . TTFields ansøgning in vitro og in vivo viste sig at hæmme både væksten af forskellige cancercellelinier og tumorernes progression i flere dyrtumormodeller 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Pilot kliniske forsøg og større randomiserede undersøgelser hos patienter med solide tumorer, herunder glioblastom og ikke-småcellet lungekræft, har demonstrationbedømt sikkerheden og effekten af kontinuerlig TTFields ansøgning 8, 9, 10. Effektiviteten af TTFields viste sig at være: (1) frekvensafhængig, med specifikke optimale frekvenser fører til det største fald i celletallene af cellelinier fra forskellige oprindelser 1, 2, 4, 5, 6, 7; (2) elektrisk feltintensitet-afhængig, med en minimal tærskel for aktivitet på omkring 1 V / cm og mere potente højere intensiteter 1, 2, 7, 11; (3) forøget, når behandlingsvarigheden var længere 5; og (4) højere, når 2 retningsbestemte TTFields blev påført vinkelret på hver othEr, sammenlignet med elektriske felter påført fra en enkelt retning 1 . På baggrund af ovenstående fund kan TTFields anvendes til patienter i lang varighed ved anvendelse af 2 sæt transducer arrays lokaliseret på patientens hud for at maksimere de elektriske feltintensiteter i tumorlejet 12 , 13 .
At studere virkningerne af TTFields på kræftceller in vitro giver i øjeblikket den eneste måde at bestemme den optimale frekvens til at anvende på en bestemt tumortype. Afprøvning af den optimale frekvens kræver en enhed, der muliggør anvendelse af forskellige frekvenser i området fra 100-500 kHz og ved intensiteter på op til 3 V / cm rotmiddelkvadrat (RMS) til cellekulturen. Da TTFields applikation producerer varme, kræver applikationssystemet evnen til at udlede overdreven varme, mens der opretholdes tæt kontrol over temperaturen.
Flere enheder were udviklet gennem årene for at muliggøre TTFields ansøgning til cellekulturer 1, 2, 5, 14, 15, 16. I alle disse indretninger blev elektroderne anvendte isolerede for at undgå de forbehold forbundet med anvendelsen af ledende elektroder, såsom elektron udveksling på elektrodeoverfladen og frigivelsen af toksiske metalioner ind i mediet 1. Den væsentligste forskel mellem de forskellige TTFields ansøgning afprøvede systemer er den type elektrode isolering anvendt med enten elektroder fremstillet af metaltråde isoleret med en tynd film af isolatoren 2, 14, 15, 16 eller med en høj dielektrisk-konstant materiale (fx, bly magnesium niobate-bly titanatE (PMN-PT)) 6 . Selvom de isolerede ledningselektroder tilbyder en forholdsvis enkel og omkostningseffektiv løsning til TTFields applikation, er de ofte begrænset af den høje spænding, der kræves for at opnå effektive elektriske feltintensiteter over 1 V / cm tærsklen og af overfladen tilgængelig til celleplating, Da afstanden mellem elektroderne er forholdsvis lille. Systemer baseret på elektroder isoleret ved hjælp af et højt dielektrisk konstant materiale kræver specielle design- og fremstillingsevner, men de kræver ikke højspænding og kan tilbyde et større område til cellevækst mellem elektroderne.
TTFields in vitro applikationssystem, der anvendes i dette værk, tilhører den sidstnævnte klasse af systemer, hvor kerneenheden er en petriskål (TTFields skål, se figur 1 ) sammensat af høj dielektrisk konstant keramik ( dvs. PMN-PT). To par elektroder udskrives vinkelret på den ydre valsLs af en TTFields skål for at tillade anvendelse af elektriske felter fra 2 retninger. Elektroderne er forbundet til en sinusformet bølgeformgenerator og en forstærker, som tillader TTFields-applikation i frekvensområdet 50-500 kHz. For at sprede den overdrevne varme opbevares TTFields-skålene inde i en nedkølet inkubator, idet middeltemperaturreguleringen udføres ved konstant overvågning af skåltemperaturen og justeringer af den spænding, som systemet anvender. I praksis vil indstillingen af inkubatoren til en lavere temperatur føre til højere elektriske feltintensiteter, da systemet øger spændingen, indtil måltemperaturen inden for fadet opnås. Forskellen mellem temperaturen i skålen og inkubatortemperaturen kan føre til en vis fordampning afhængigt af temperaturgradienterne; Derfor skal kulturmediet udskiftes hver 24. time for at opretholde passende vækstbetingelser.
Protokollen nedenforBeskriver den eksperimentelle procedure for at optimere anvendelsen af TTFields frekvenser til kræftceller, således at der opnås en maksimal reduktion i celletælling og en reduktion i potentialet hos de overlevende celler til dannelse af kolonier.
TTFields er en spirende antitumor-modalitet baseret på den fortsatte anvendelse af korrekt indstillede alternerende elektriske felter 1, 2, 8, 9, 10, 17. Maksimering antitumoreffektivitet er en ønskelig resultat for alle behandlingsmodaliteter. Således kan "kæmper" for hver ekstra procent af kræft cellevækst hæmning have en betydelig indvirkning på den langsigtede kliniske resultat for patienterne. Dette er på grund af den krævede vedvarende karakter TTFields ansøgning og den resulterende kumulative effekt. Maksimering TTFields ansøgning kan opnås på flere måder: (1) forøgelse af det elektriske felt intensitet 1, 7, (2) forlængelse behandlingsvarighed 5, (3) at finde den mest effektive combinatipå med andre behandlingsmodaliteter 18, 19 og (4), der definerer den optimale frekvens 1, 2, 4, 6, 7. Maksimering det elektriske felt intensitet på stedet for tumoren opnås ved at optimere placeringen af arrays på patientens hud; dette giver mulighed for levering af den maksimale feltintensitet til tumoren baseret på den enkelte patientens anatomi 20. Forlængelse behandlingsvarighed meste afhængig af patientens overholdelse af behandlingen (i mindst 18 timer om dagen) 17. At finde den rigtige kombination med andre behandlinger og bestemme den optimale frekvens er stærkt afhængig in vitro-resultater, som ingen validerede markører for TTFields behandlingsresultater er i øjeblikket tilgængelige. I dette arbejde har vi skitseret den eksperimentelle pROCEDURER kræves for at bestemme den optimale TTFields frekvens for kræft cellelinier ved anvendelse af TTFields in vitro ansøgningssystemet. De her beskrevne metoder kan potentielt anvendes til at screene kombination af andre modaliteter cancer (fx kemoterapimidler eller bestråling) med TTFields og at bestemme den optimale frekvens for TTFields administration for hver specifik kombineret behandling.
I overensstemmelse med tidligere publikationer, der er vist her resultater viser, at den optimale frekvens for behandling af både gliomceller og ovariecancerceller er 200 kHz 1, 7. I dette arbejde viste vi for første gang, at det optimale TTFields frekvens for at reducere klonogeniske potentiale er forbundet med den hyppighed, der fører til den maksimale cytotoksiske virkning. De i dette arbejde anvendte metoder til at kvantificere virkningen af TTFields (dvs. cytotoksiske og klonogene) enre kun to af mange mulige standard endpoint analyser for at vurdere behandlingsresultater. Yderligere udfald behandling test omfatter: (1) fastsættelse farvning, og montering dækglassene hvorpå cellerne udplades over et mikroskop til visualisering af intracellulære strukturer; (2) udførelse af assays af protein- og RNA-ekstrakter, enten fra TTFields retter selv eller efter overførsel dækglasset til en ny engangs skål; og (3) trypsinbehandling af celler farvet til flowcytometri analyse.
Omhyggelig eksperimentel planlægning vil påvirke behandlingsresultater efter indlevering af TTFields. De vigtigste skridt indgår, at celleproliferation hele forsøget ikke fører til overvækst og anvendelse af det passende elektriske felt intensitet, som intensiteter, der er for høj, når den anvendes på følsomme cellelinjer vil resultere i for-få celler til de krævede assays til bestemmelse den optimale frekvens. Omvendt TTFields anvendt ved meget lave intensiteterPå mindre følsomme cellelinier vil det resultere i små effekter, som kan maskeres ved iboende variation. Behandlingslogfilerne bør undersøges for værdifulde oplysninger om temperaturstabilitet, elektriske strømme og modstand for hver enkelt parabol gennem hele eksperimentet. Udskiftning af defekte retter ved behandlingstart og udelukkelse af data fra en skål, der ikke opfyldte de ønskelige behandlingsparametre, minimerer variationen mellem replikater.
Sammenfattende er TTFields en fremvækst mod cancerbehandling modalitet, der allerede har vist effekt og sikkerhed i kliniske indstillinger 8 , 9 , 10 . Testning af TTFields i en in vitro- indstilling ved hjælp af de her beskrevne protokoller kan muliggøre optimering af TTFields behandlingsparametre i den kliniske indstilling og kan udvide vores forståelse af den underliggende virkningsmekanisme.
The authors have nothing to disclose.
Forfattere har ingen anerkendelser.
inovitro system and software | Novocure | ITG1000 and IBP1000 | Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable. |
Sterilization bags | Westfield medical | 24882 | |
Plastic cover slides | Thermo Scientific (NUNC) | 174977 | Pre treated and sterilized |
Glass cover slides | Thermo Scientific (Menzel-Gläser) | CB00220RA1 | Sterilize if necessary |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Biological Industries (Israel) | 01-055-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | Warm in 37 °C water bath before use |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries (Israel) | 04-007-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-029 | |
Pen/Strep (10000 U/mL Penicillin, 10000 µg/mL Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Sodium Pyruvate solution 100 mM | Biological Industries (Israel) | 03-042-1B | |
Hepes buffer 1M | Biological Industries (Israel) | 03-025-1B | |
Insuline solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10516-5ML | |
0.25% Trypsin/EDTA | Biological Industries (Israel) | 03-050-1B | Warm in 37 °C water bath before use |
Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Cool to -20 °C in the freezer before use |
Crystal violet | Sigma-Aldrich | 120M1445 | Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water. |
Light detergent | Alcononx | 242985 | Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer's instrutions. |
PBS | Biological Industries (Israel) | 02-023-1A | Without calcium and magnesium |
A2780 | ECACC | 93112519 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12mM). |
F98 | ATCC | CRL-2397 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
Ovcar-3 | ATCC | HTB-161 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insuline (10 µg/mL). |
U-87 MG | ATCC | HTB-14 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
refrigirated CO2 incubator | CARON | 7404-10-3 | |
Laminar flow cabinet | ADS Laminair | Bio12 and VSM12 |