Tumor Behandling felter (TTFields) er et effektivt antitumorbehandling modalitet leveres via kontinuerlige, ikke-invasiv påføring av lav intensitet, mellomfrekvens, vekslende elektriske felt. TTFields påføring på cellelinjer ved hjelp av en TTFields in vitro anvendelse system gjør det mulig for bestemmelse av den optimale frekvens som fører til den høyeste reduksjon i celletall.
Tumor Behandling Felt (TTFields) er en effektiv behandlingsform leveres via kontinuerlige, ikke-invasiv påføring av lav-intensitet (1-3 V / cm), vekslende elektrisk felt i frekvensområdet på flere hundre kHz. Studiet av TTFields i vevskultur blir utført ved hjelp av TTFields in vitro anvendelse system, som gjør det mulig for påføring av elektriske felt av varierende frekvenser og intensiteter til keramiske Petri-skåler med en høy dielektrisk konstant (Ɛ> 5000). Cancerøse cellelinjer belagt på dekkglass i bunnen av de keramiske petriskåler utsettes for TTFields levert i to ortogonale retninger ved forskjellige frekvenser for å lette behandlingsresultat tester, for eksempel celletellinger og klonogene analyser. Resultatene presentert i denne rapport viser at den optimale frekvens av den TTFields både med hensyn til celletellinger og klonogene analyser er 200 kHz for begge ovarier og glioma-celler.
Tumorbehandlingsfelt (TTFields) er en anti-mitotisk modalitet for behandling av glioblastom multiforme og potensielt andre krefttyper. Feltene leveres via kontinuerlig applikasjon med lav intensitet (1-3 V / cm), mellomfrekvens (100-500 kHz), vekslende elektriske felter til tumorområdet 1 , 2 . TTFields applikasjon in vitro og in vivo ble vist å hemme både veksten av forskjellige kreftcellelinjer og fremdriften av svulstene i flere dyrtumormodeller 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Pilot kliniske studier og større randomiserte studier hos pasienter med solide tumorer, inkludert glioblastom og ikke-småcellet lungekreft, har demonstrasjonvurdert sikkerheten og effektiviteten av kontinuerlig TTFields søknad 8, 9, 10. Effektiviteten av TTFields ble funnet å være: (1) frekvensavhengig, med bestemte optimale frekvenser som fører til den høyeste reduksjon i legemer på cellelinjer fra forskjellige steder for 1, 2, 4, 5, 6, 7; (2) elektrisk feltintensitetsavhengig, med en minimal terskel for aktivitet på rundt 1 V / cm og mer potente høyere intensitet 1, 2, 7, 11; (3) øket når den behandlingstid var lengre 5; og (4) høyere når 2 retnings TTFields ble påført vinkelrett på hver OTHEr, sammenlignet med elektriske felter påført fra en enkelt retning 1 . Basert på de ovennevnte funnene, kan TTFields brukes til pasienter i lang varighet ved å bruke 2 sett med transduserarrayer lokalisert på pasientens hud for å maksimere de elektriske feltintensiteter i svulstesengen 12 , 13 .
Å studere effektene av TTFields på kreftceller in vitro, gir for øyeblikket den eneste måten å bestemme den optimale frekvensen som skal gjelde for en bestemt svulstype. Testing for optimal frekvens krever en enhet som muliggjør bruk av forskjellige frekvenser i området 100-500 kHz og ved intensiteter på opptil 3 V / cm rotmiddelkvadrat (RMS) til cellekulturen. Når TTFields applikasjon produserer varme, krever applikasjonssystemet muligheten til å utløse overdreven varme samtidig som det opprettholdes tett kontroll over temperaturen.
Flere enheter were er utviklet gjennom årene for å tillate TTFields påføring på cellekulturer 1, 2, 5, 14, 15, 16. I alle disse anordninger ble de elektroder som benyttes isolert for å unngå de begrensninger som er involvert ved bruk av ledende elektroder, slik som elektronutveksling ved elektrodeoverflaten og frigjøring av toksiske metallioner i mediet 1. Hovedforskjellen mellom de forskjellige TTFields påføringssystemer som ble testet er den type elektrode isolasjon brukes, enten med elektroder fremstilt av metalltråder, isolert med en tynn film av isolatoren 2, 14, 15, 16 eller med en høy dielektrisk konstant materiale (f.eks, bly magnesium niobat-bly-titanate (PMN-PT)) 6. Mens isolert-trådelektroder har en relativt enkel og kostnadseffektiv løsning for TTFields anvendelse, er de ofte begrenses av den høye spenning som er nødvendig for å oppnå effektive elektriske feltstyrker over 1 V / cm terskel og ved den overflate tilgjengelig for celleplettering, som avstanden mellom elektrodene er forholdsvis liten. Systemer basert på elektroder isolert ved hjelp av en høy dielektrisk konstant materiale krever spesielle design og produksjon evner, men de krever ikke høy spenning og kan tilby et større område for cellevekst mellom elektrodene.
Den TTFields in vitro anvendelse som brukes i dette arbeidet tilhører den sistnevnte klasse av systemer, med kjerneenheten være en petriskål (TTFields skål, se figur 1) som består av høy dielektrisk konstant keramikk (dvs. PMN-PT). To par elektroder er trykt vinkelrett på den ytre walls av en TTFields skål for å tillate påføring av elektriske felt fra 2 retninger. Elektrodene er forbundet med en sinusformet bølgeformgenerator og en forsterker, som gir mulighet for TTFields anvendelse i frekvensområdet 50-500 kHz. For å spre den overdreven varme, er TTFields retter holdt inne i en nedkjølt inkubator, med det mellomtemperaturkontroll utføres ved bruk av konstant overvåking av fatet temperatur og tilpasninger til den spenning som påtrykkes av systemet. I praksis vil sette kuvøse til en lavere temperatur fører til høyere elektriske feltstyrker, som det systemet øker spenningen til ønsket temperatur innenfor fatet er oppnådd. Forskjellen mellom temperaturen inne i fatet og inkubatoren temperatur kan føre til en viss fordampning, avhengig av temperaturgradientene; dermed må kulturmediet må byttes hver 24 timer for å opprettholde tilstrekkelig vekstvilkår.
Protokollen nedenforbeskriver den eksperimentelle fremgangsmåte for å optimalisere anvendelsen av TTFields frekvenser til kreftceller, slik at en maksimal reduksjon i celletall og en reduksjon i potensialet av de overlevende celler til å danne kolonier blir oppnådd.
TTFields er en fremvoksende antitumormodalitet basert på kontinuerlig anvendelse av ordentlige avstemte alternerende elektriske felt 1 , 2 , 8 , 9 , 10 , 17 . Maksimering av antitumor-effekt er et ønskelig resultat for alle behandlingsmodaliteter. Dermed kan "slåss" for hver ytterligere prosent av kreftcelleveksthemming ha en signifikant effekt på det langsiktige kliniske utfallet for pasienter. Dette skyldes den nødvendige kontinuerlige naturen til TTFields applikasjon og den resulterende kumulative effekten. Maksimering av TTFields-applikasjonen kan oppnås på flere måter: (1) øke den elektriske feltintensiteten 1 , 7 , (2) lengre behandlingsvarighet 5 , (3) finne den mest effektive kombinasjonenvidere med andre behandlingsformer 18, 19, og (4) som definerer den optimale frekvens 1, 2, 4, 6, 7. Maksimering den elektriske feltstyrke på stedet av tumoren er oppnådd ved å optimalisere plasseringen av gruppene på pasientens hud; Dette gjør det mulig for levering av den maksimale feltstyrke til tumoren basert på den enkelte anatomien til pasienten 20. Forlengelse behandlingsvarighet for det meste avhengig av pasientens etterlevelse av behandling (i minst 18 timer per dag) 17. Å finne den riktige kombinasjon med andre behandlinger, og å bestemme den optimale frekvens er sterkt avhengig av in vitro-resultater som ikke validerte markører for TTFields behandlingsresultatene er for tiden tilgjengelige. I dette arbeidet har vi skissert den eksperimentelle pRutiner som kreves for å bestemme den optimale TTFields-frekvensen for kreftcellelinjer ved bruk av TTFields in vitro- applikasjonssystemet. Metodene beskrevet her kan potensielt brukes til å skjerme kombinasjonen av andre kreftbehandlingsmodaliteter ( f.eks. Kjemoterapimidler eller bestråling) med TTFields og å bestemme den optimale frekvensen for TTFields administrering for hver spesifikk kombinert behandling.
I tråd med tidligere publikasjoner viser resultatene som vises her at den optimale frekvensen for behandling av både gliomceller og eggstokkreftceller er 200 kHz 1 , 7 . I dette arbeidet viste vi for første gang at den optimale TTFields frekvensen for å redusere det klonogene potensialet er forbundet med frekvensen som fører til den maksimale cytotoksiske effekten. Metodene som brukes i dette arbeidet for å kvantifisere effektene av TTFields ( dvs. cytotoksisk og klonogen) aRe bare to av mange mulige standard endpoint-analyser for å evaluere behandlingsresultater. Ytterligere behandlingsresultat tester inkluderer: (1) fiksering, farging og montering av dekselene på hvilke cellene er belagt over et mikroskop for visualisering av intracellulære strukturer; (2) utføre analyser av protein- og RNA-ekstrakter, enten fra TTFieldsene seg selv eller etter overføring av dekslet til en ny engangsskål; Og (3) trypsiniserende celler farget for strømningscytometrianalyse.
Forsiktig eksperimentell planlegging vil påvirke behandlingsresultatene etter levering av TTFields. Nøkkeltrinnene inkluderer å sikre at celleproliferasjonen i hele forsøket ikke fører til overgrov og ved bruk av den riktige elektriske feltintensiteten, da intensiteter som er for høye når de påfølsomme cellelinjer, vil resultere i for få celler for de nødvendige analysene for å bestemme Den optimale frekvensen. Omvendt ble TTFields anvendt ved svært lave intensiteterPå mindre følsomme cellelinjer vil det resultere i små effekter som kan maskeres av iboende variasjon. Behandlingsloggene bør undersøkes for verdifull informasjon om temperaturstabilitet, elektriske strømmer og motstand for hver tallerken gjennom hele forsøket. Bytte feilte retter ved behandlingsstart og ekskludering av data fra en tallerken som ikke oppfyller de ønskelige behandlingsparametrene, vil minimere variabiliteten mellom replikater.
Oppsummert er TTFields en fremvoksende anticancerbehandlingsmodalitet som allerede har vist effekt og sikkerhet i kliniske innstillinger 8 , 9 , 10 . Testing av TTFields i en in vitro- innstilling ved hjelp av protokollene beskrevet her kan muliggjøre optimalisering av TTFields behandlingsparametere i den kliniske innstillingen og kan utvide vår forståelse av den underliggende virkningsmekanismen.
The authors have nothing to disclose.
Forfattere har ingen bekreftelser.
inovitro system and software | Novocure | ITG1000 and IBP1000 | Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable. |
Sterilization bags | Westfield medical | 24882 | |
Plastic cover slides | Thermo Scientific (NUNC) | 174977 | Pre treated and sterilized |
Glass cover slides | Thermo Scientific (Menzel-Gläser) | CB00220RA1 | Sterilize if necessary |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Biological Industries (Israel) | 01-055-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | Warm in 37 °C water bath before use |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries (Israel) | 04-007-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-029 | |
Pen/Strep (10000 U/mL Penicillin, 10000 µg/mL Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Sodium Pyruvate solution 100 mM | Biological Industries (Israel) | 03-042-1B | |
Hepes buffer 1M | Biological Industries (Israel) | 03-025-1B | |
Insuline solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10516-5ML | |
0.25% Trypsin/EDTA | Biological Industries (Israel) | 03-050-1B | Warm in 37 °C water bath before use |
Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Cool to -20 °C in the freezer before use |
Crystal violet | Sigma-Aldrich | 120M1445 | Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water. |
Light detergent | Alcononx | 242985 | Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer's instrutions. |
PBS | Biological Industries (Israel) | 02-023-1A | Without calcium and magnesium |
A2780 | ECACC | 93112519 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12mM). |
F98 | ATCC | CRL-2397 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
Ovcar-3 | ATCC | HTB-161 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insuline (10 µg/mL). |
U-87 MG | ATCC | HTB-14 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
refrigirated CO2 incubator | CARON | 7404-10-3 | |
Laminar flow cabinet | ADS Laminair | Bio12 and VSM12 |