Tumör Behandla Fields (TTFields) är ett effektivt anti-tumörbehandling modalitet levereras via det kontinuerliga, icke-invasiv applicering av lågintensiva, mellanfrekvens, omväxlande elektriska fält. TTFields applicering till cellinjer med användning av en TTFields in vitro ansökan system möjliggör bestämning av den optimala frekvensen som leder till den högsta minskningen i cellantal.
Tumör Behandling Fields (TTFields) är en effektiv behandling modalitet levereras via det kontinuerliga, icke-invasiv applicering av låg intensitet (1-3 V / cm), omväxlande elektriska fält i frekvensområdet av flera hundra kHz. Studien av TTFields i vävnadskultur utförs med användning av de TTFields i ansökan vitro-system, som medger applicering av elektriska fält med varierande frekvenser och intensiteter till keramiska petriskålar med en hög dielektrisk konstant (ɛ> 5000). Cancerösa cellinjer pläterade på täckglas vid botten av de keramiska petriskålar utsätts för TTFields levereras i två ortogonala riktningar vid olika frekvenser för att underlätta behandlingsutfalls tester, såsom cellräkning och klonogena analyser. De resultat som presenteras i denna rapport visar att den optimala frekvensen av de TTFields med avseende på både cellantal och klonogena analyser är 200 kHz för både äggstocks- och gliomceller.
Tumörbehandlingsfält (TTFields) är en anti-mitotisk modalitet för behandling av glioblastom multiforme och potentiellt andra cancertyper. Fälten levereras via kontinuerlig tillämpning av låg intensitet (1-3 V / cm), mellanfrekvens (100-500 kHz), alternerande elektriska fält till tumörområde 1 , 2 . TTFields applikation in vitro och in vivo visade sig inhibera både tillväxten av olika cancercellinjer och tumörernas progression i flera djurtumormodeller 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Pilot kliniska prövningar och större randomiserade studier hos patienter med fasta tumörer, inklusive glioblastom och lungcancer från små celler, har demonstrationBedömde säkerheten och effekten av kontinuerlig applikation TTFields 8 , 9 , 10 . Effekten av TTFields visade sig vara: (1) frekvensberoende, med specifika optimala frekvenser som leder till den högsta minskningen av cellantalet av cellinjer från olika ursprung 1 , 2 , 4 , 5 , 6 , 7 ; (2) elektrisk fältintensitetsberoende, med en minimal tröskel för aktivitet vid omkring 1 V / cm och mer potent högre intensiteter 1 , 2 , 7 , 11 ; (3) förbättrad när behandlingsvaraktigheten var längre 5 ; Och (4) högre när 2-riktiga TTFields applicerades vinkelrätt mot vardera othEr, jämfört med elektriska fält applicerade från en enda riktning 1 . Baserat på ovanstående fynd kan TTFields appliceras på patienter under långa varaktigheter med användning av 2 uppsättningar givaruppsättningar lokaliserade på patientens hud för att maximera de elektriska fältintensiteterna i tumörbädden 12 , 13 .
Studier av effekterna av TTFields på cancerceller in vitro ger för närvarande det enda sättet att bestämma den optimala frekvensen som ska tillämpas på en specifik tumortyp. Testning av den optimala frekvensen kräver en anordning som möjliggör tillämpning av olika frekvenser inom intervallet 100-500 kHz och vid intensiteter upp till 3 V / cm rotmedelkvadrat (RMS) till cellkulturen. Eftersom TTFields applikation ger värme, kräver applikationssystemet förmågan att släppa ut överdriven värme samtidigt som den håller tätt kontroll över temperaturen.
Flera enheter were utvecklats genom åren för att möjliggöra TTFields applicering till cellkulturer 1, 2, 5, 14, 15, 16. I alla dessa anordningar, var elektroderna som används isolerade för att undvika de förbehåll som är involverade med användningen av ledande elektroder, såsom elektronutbyte vid elektrodytan och frisättningen av toxiska metalljoner in i mediet 1. Den största skillnaden mellan de olika TTFields applikationssystem som testats är den typ av elektrodisolering används, med antingen elektroder tillverkade av metalltrådar som är isolerade med en tunn film av isolatorn 2, 14, 15, 16 eller med en hög dielektrisk konstant material (till exempel, bly magnesium niobat-bly titanate (PMN-PT)) 6. Medan de isolerade-trådelektroder erbjuder en relativt enkel och kostnadseffektiv lösning för TTFields ansökan, är de ofta begränsas av den höga spänning som krävs för att uppnå effektiva elektriska fältintensitet ovanför en V / cm tröskel och av ytan tillgänglig för cell plätering, som avståndet mellan elektroderna är relativt liten. System baserade på elektroder isolerade med hjälp av en hög dielektrisk konstant material kräver speciella konstruktion och tillverkning kapacitet, men att de inte kräver hög spänning och kan erbjuda ett större område för celltillväxt mellan elektroderna.
Den TTFields in vitro appliceringssystem som används i detta arbete hör till den senare klassen av system, med kärnenheten är en Petri-skål (TTFields skålen, se figur 1) bestående av hög dielektrisk konstant keramik (dvs PMN-PT). Två par av elektroder är vinkelrätt tryckt på ytter walls av en TTFields skålen för att möjliggöra applicering av elektriska fält från 2 riktningar. Elektroderna är anslutna till en sinusformad vågform generator och en förstärkare, som möjliggör TTFields tillämpning i frekvensområdet 50-500 kHz. I syfte att avleda den hög värme, är TTFields rätter hålls i en kyld inkubator, med mediet temperaturstyrning utförs med användning av konstant övervakning av skålen temperaturen och justeringar till den spänning som tillämpas av systemet. I praktiken skulle ställa inkubatorn till en lägre temperatur leda till högre elektriska fältintensitet, eftersom systemet ökar spänningen tills måltemperaturen inuti skålen uppnås. Skillnaden mellan temperaturen i skålen och inkubatortemperaturen kan leda till en viss förångning, beroende på temperaturgradienter; följaktligen behöver bytas var 24: e h för att upprätthålla tillräckliga tillväxtbetingelser odlingsmediet.
Protokollet nedanBeskriver det experimentella förfarandet för att optimera appliceringen av TTFields frekvenser till cancerceller så att en maximal minskning av cellantalet och en minskning av potentialen hos de överlevande cellerna för att bilda kolonier uppnås.
TTFields är en framväxande antitumör modalitet baserad på kontinuerlig tillämpning av korrekt avstämda alternerande elektriska fält 1, 2, 8, 9, 10, 17. Maximera antitumör effektivitet är ett önskvärt resultat för alla behandlingsformer. Således kan "slåss" för varje ytterligare procent av cancercelltillväxthämning ha en betydande effekt på den långsiktiga kliniska resultat för patienterna. Detta är på grund av den nödvändiga fortlöpande karaktär TTFields ansökan och den resulterande kumulativa effekten. Maximera TTFields applikation kan uppnås på flera sätt: (1) ökning av den elektriska fältstyrkan 1, 7, (2) förlängning behandlingstid 5, (3) att hitta den mest effektiva kombinatioPå med andra behandlingsmodaliteter 18 , 19 och (4) som definierar den optimala frekvensen 1 , 2 , 4 , 6 , 7 . Maximering av den elektriska fältintensiteten vid tumörplatsen uppnås genom optimering av placeringen av arraysna på patientens hud; Detta möjliggör avgivning av maximal fältintensitet till tumören baserat på patientens individuella anatomi 20 . Längre behandlingsvaraktighet beror mest på patientens efterlevnad av behandlingen (minst 18 timmar per dag) 17 . Att hitta rätt kombination med andra terapier och bestämma den optimala frekvensen är starkt beroende av in vitro- resultat, eftersom inga validerade markörer för TTFields behandlingsresultat är tillgängliga för närvarande. I det här arbetet har vi skisserat experimentet pRutiner som krävs för att bestämma den optimala TTFields-frekvensen för cancercellinjer med användning av TTFields in vitro applikationssystem. Metoderna som beskrivs här kan eventuellt användas för att skärma kombinationen av andra cancerbehandlingsmodaliteter ( t.ex. kemoterapeutiska medel eller bestrålning) med TTFields och för att bestämma den optimala frekvensen för TTFields administrering för varje specifik kombinerad behandling.
I linje med tidigare publikationer visar resultaten som visas här att den optimala frekvensen för behandling av både gliomceller och äggcancerceller är 200 kHz 1 , 7 . I detta arbete demonstrerade vi för första gången att den optimala TTFields frekvensen för att minska den klonogena potentialen är associerad med frekvensen som leder till maximal cytotoxisk effekt. De metoder som används i detta arbete för att kvantifiera effekterna av TTFields ( dvs cytotoxiska och klonogena) aRe endast två av många möjliga standard-endpointanalyser för att utvärdera behandlingsresultat. Ytterligare behandlingsresultattester inkluderar: (1) fixering, färgning och montering av täckglasen på vilka cellerna är pläterade över ett mikroskop för visualisering av intracellulära strukturer; (2) utföra analyser av protein- och RNA-extrakt, antingen från TTFields-disken själva eller efter överföring av täckglaset till en ny engångsskål; Och (3) trypsiniserande celler färgade för flödescytometrianalys.
Noggrann experimentplanering kommer att påverka behandlingsresultaten efter leveransen av TTFields. De viktigaste stegen är att säkerställa att cellproliferationen genom experimentet inte leder till överväxt och med användning av lämplig elektrisk fältintensitet, eftersom intensiteter som är för höga när de appliceras på känsliga cellinjer kommer att resultera i för få celler för de erforderliga analyserna för att bestämma Den optimala frekvensen. Omvänt applicerades TTFields vid mycket låga intensiteterPå mindre känsliga celllinjer kommer det att resultera i små effekter som kan maskeras av inneboende variationer. Behandlingsloggarna bör undersökas för värdefull information om temperaturstabilitet, elektriska strömmar och motstånd för varje maträtt under experimentet. Byte av felaktiga rätter vid behandlingstart och exklusive data från en maträtt som inte uppfyllde de önskvärda behandlingsparametrarna minskar variationen mellan replikat.
Sammanfattningsvis är TTFields en framväxande behandling mot cancerbehandling som redan har visat effekt och säkerhet i kliniska inställningar 8 , 9 , 10 . Testning av TTFields i en in vitro- inställning med de protokoll som beskrivs här kan möjliggöra optimering av TTFields behandlingsparametrar i den kliniska inställningen och kan bredda vår förståelse av den underliggande verkningsmekanismen.
The authors have nothing to disclose.
Författare har inga bekräftelser.
inovitro system and software | Novocure | ITG1000 and IBP1000 | Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable. |
Sterilization bags | Westfield medical | 24882 | |
Plastic cover slides | Thermo Scientific (NUNC) | 174977 | Pre treated and sterilized |
Glass cover slides | Thermo Scientific (Menzel-Gläser) | CB00220RA1 | Sterilize if necessary |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Biological Industries (Israel) | 01-055-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | Warm in 37 °C water bath before use |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries (Israel) | 04-007-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-029 | |
Pen/Strep (10000 U/mL Penicillin, 10000 µg/mL Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Sodium Pyruvate solution 100 mM | Biological Industries (Israel) | 03-042-1B | |
Hepes buffer 1M | Biological Industries (Israel) | 03-025-1B | |
Insuline solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10516-5ML | |
0.25% Trypsin/EDTA | Biological Industries (Israel) | 03-050-1B | Warm in 37 °C water bath before use |
Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Cool to -20 °C in the freezer before use |
Crystal violet | Sigma-Aldrich | 120M1445 | Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water. |
Light detergent | Alcononx | 242985 | Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer's instrutions. |
PBS | Biological Industries (Israel) | 02-023-1A | Without calcium and magnesium |
A2780 | ECACC | 93112519 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12mM). |
F98 | ATCC | CRL-2397 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
Ovcar-3 | ATCC | HTB-161 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insuline (10 µg/mL). |
U-87 MG | ATCC | HTB-14 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
refrigirated CO2 incubator | CARON | 7404-10-3 | |
Laminar flow cabinet | ADS Laminair | Bio12 and VSM12 |