Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7
Summary
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, funktionale Nanosensoren für die Portable, kostengünstig, zu synthetisieren und schnelle Erkennung von gezielt pathogene Bakterien durch eine Kombination von magnetischen Entspannung und Fluoreszenz Emission Modalitäten.
Abstract
Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 wurde für beide wasserbasierte verbunden und lebensmittelbedingten Erkrankungen, und bleibt eine Bedrohung trotz der Nahrung und Wasser-Screening-Methoden verwendet derzeit. Während konventionelle bakterielle Nachweisverfahren wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA) speziell Pathogene Verunreinigungen erkennen können, benötigen sie umfangreiche Probenvorbereitung und lange Wartezeiten. Darüber hinaus sind diese Praktiken fordern anspruchsvolle Laborgeräte und Einstellungen, und müssen von ausgebildeten Fachleuten ausgeführt werden. Hierin wird ein Protokoll für eine einfachere diagnostische Technik vorgeschlagen, die die einzigartige Kombination von magnetischen und fluoreszierenden Parameter in ein Nanopartikel-basierte Plattform bietet. Die vorgeschlagenen multiparametric Magneto-fluoreszierende Nanosensoren (MFnS) erkennt E. Coli O157: H7 Kontamination mit so wenig wie 1 koloniebildenden Einheit in Lösung innerhalb von weniger als 1 h vorhanden. Darüber hinaus die Fähigkeit der MFnS hochfunktionelle in komplexen Medien bleiben wie Milch und Wasser des Sees verifiziert wurde. Weitere Besonderheit Assays dienten auch die Fähigkeit des MFnS, nur zu erkennen, die gezielt Bakterien, auch in Gegenwart von ähnlichen Bakterienarten nachweisen. Die Kopplung der magnetischen und fluoreszierenden Modalitäten ermöglicht die Erkennung und Quantifizierung von Pathogenkontamination in einer Vielzahl von Zusammenschlüssen, seine hohe Leistung in beiden frühen und späten Stadium Fremdkörpererkennung ausstellen. Wirksamkeit, Erschwinglichkeit und Übertragbarkeit von der MFnS machen sie einen idealen Kandidat für Point-of-Care-Screening für bakterielle Verunreinigungen in einer Vielzahl von Einstellungen, von aquatischen Stauseen zu kommerziell verpackten Lebensmitteln.
Introduction
Das dauerhafte auftreten der bakteriellen Kontamination in beiden kommerziell produzierte Lebensmittel und Wasser-Quellen müssen zunehmend schnellen und spezifischen diagnostischen Plattformen geschaffen hat. 1 , 2 einige der häufigeren bakterielle Verunreinigungen für Nahrung und Wasser Kontamination verantwortlich sind aus den Salmonellen, Staphylokokken, Listerien, Vibrio, Shigella, Bacillus und Escherichia Gattungen. 3 , 4 bakterielle Kontamination durch diese Erreger häufig führt zu Symptomen wie Durchfall, Fieber, Cholera und Gastroenteritis. 4 Kontamination von Wasser-Quellen oft hat drastische und nachteilige Auswirkungen auf die Gemeinden ohne Zugang zu ausreichend gefiltertes Wasser und Kontamination von Lebensmitteln führte zu zahlreichen Erkrankungen und Produkt-Rückruf-Bemühungen. 5 , 6
Um das Auftreten von Erkrankungen durch bakterielle Kontamination zu reduzieren, wurden eine Reihe von Maßnahmen, Methoden zu entwickeln, mit denen Wasser und Nahrung effizient vor Verkauf oder Verbrauch gescannt werden können. 3 Techniken wie PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,12 Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung) Lampe),13,14 u. a.15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 haben vor kurzem für die Erkennung von verschiedenen Krankheitserregern verwendet worden. Im Vergleich zu traditionellen bakterielle Kultivierung Methoden, sind diese Techniken wesentlich effizienter im Hinblick auf Spezifität und Zeit. Diese Techniken kämpfen noch mit falsch positive und negative, komplexe Verfahren und Kosten. 1 , 3 , 25 es ist aus diesem Grund, dass multiparametric Magneto-fluoreszierende Nanosensoren (MFnS) als eine alternative Methode für bakterielle Erkennung vorgeschlagen werden.
Diese Nanosensoren Paaren eindeutig zusammen magnetische Entspannung und fluoreszierende Modalitäten, so dass für eine Dual-Erkennung-Plattform, die eine schnelle und genaue. Mit E. Coli O157: H7 als eine Verunreinigung der Probe, zeigt die Fähigkeit des MFnS, so wenig wie 1 KBE innerhalb von Minuten erkennen. Erreger-spezifischen Antikörper werden verwendet, um die Spezifität zu erhöhen, und die Kombination von magnetischen und fluoreszierenden Modalitäten ermöglicht die Erkennung und Quantifizierung von bakteriellen Verunreinigungen in beiden Bereichen Low – und High-Kontamination. 16 bei bakteriellen Kontamination werden die Nanosensoren um die Bakterien durch die gezielten Fähigkeiten der Erreger-spezifischen Antikörper schwärmen. Die Bindung zwischen der magnetische Nanosensoren und Bakterien schränkt die Interaktion zwischen der magnetischen Eisenkern und die umliegenden Wasser Protonen. Dies bewirkt eine Erhöhung der T2-Relaxationszeiten von magnetischen Relaxometer aufgenommen. Da die Konzentration von Bakterien in Lösung steigt zu zerstreuen die Nanosensoren mit der erhöhten Anzahl von Bakterien, was zu niedrigeren T2-Werten. Im Gegensatz dazu erhöht Fluoreszenzemission proportional mit der Konzentration von Bakterien durch die gestiegene Zahl der Nanosensoren direkt pathogen gebunden. Zentrifugation der Proben und Isolation des bakteriellen Pellets werden nur die Nanopartikel direkt angeschlossen, die Bakterien, entfernen alle schwebenden Nanosensoren und direkt korrelieren die Fluoreszenz-Emission mit der Anzahl der sparen Bakterien in Lösung. Eine schematische Darstellung dieses Mechanismus ist in Abbildung 1dargestellt.
Diese MFnS-Plattform wurde mit Point-of-Care-Screening im Auge, was zu Low-Cost und tragbaren Eigenschaften entwickelt. MFnS sind bei Raumtemperatur stabil und müssen dann nur in sehr geringen Konzentrationen für präzise Erkennung von bakteriellen Verunreinigungen. Darüber hinaus nach der Synthese, Einsatz von der MFnS ist einfach und erfordert nicht die Verwendung von ausgebildeten Fachleuten auf dem Gebiet. Schließlich ermöglicht dieses Diagnoseplattform für hochgradig anpassbare targeting, ein Mittel, durch welche diese eine Plattform verwendet werden, um Krankheitserreger aller Art in vielen verschiedenen Einstellungen zu erkennen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um voll funktionsfähige MFnS produzieren so einfach wie möglich. Allerdings gibt es viele wichtige Punkte, die bei denen Änderung des Protokolls möglicherweise nützlich, je nach Ziel des Benutzers. Beispielsweise würde die Verwendung von verschiedenen Antikörpern für die Ausrichtung von vielen anderen Krankheitserregern ermöglichen. Darüber hinaus ist dieses Protokoll nicht beschränkt auf die Verwendung von Antikörpern als targeting Moleküle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von K-INBRE P20GM103418, Kansas Soja Kommission (KSC/PSU-1663), ACS PRF 56629-UNI7 und PSU Polymer Chemie-Gründerfonds, alle SS unterstützt. Wir danken der Universität Videofilmer, Herr Jacob Anselmi, für seine hervorragende Arbeit mit dem Video. Wir danken auch Herrn Roger Heckert und Frau Katha Heckert für ihre großzügige Unterstützung für die Forschung.
Materials
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
