मानव गुर्दा Perivascular Stromal कक्षों के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय ग्रेड अलगाव विधि

Summary

यहाँ हम एक उपन्यास चिकित्सीय ग्रेड अलगाव और संस्कृति विधि गुर्दे Perivascular Stromal पाचन एंजाइमों और NG2-कोशिका संवर्धन के साथ पूरे अंग छिड़काव पर आधारित कक्षों (kPSCs) के लिए मौजूद है। इस विधि के साथ, यह सेलुलर थेरेपी के लिए पर्याप्त कक्ष संख्या प्राप्त करने के लिए संभव है।

Abstract

Mesenchymal Stromal कोशिकाओं (MSCs) कि ट्रांसप्लांटेशन और गुर्दे की बीमारियों में लाभकारी प्रभाव दिखाया है ऊतक homeostatic और प्रतिरक्षा modulatory कोशिकाओं रहे हैं। Perivascular Stromal कोशिकाओं (पीएससी) अस्थि मज्जा MSCs (bmMSCs) के साथ विशेषताएँ साझा करें। हालांकि, वे भी, सबसे अधिक संभावना के कारण स्थानीय imprinting, ऊतक-विशिष्ट गुणों और स्थानीय ऊतक समस्थिति में एक भूमिका निभा के अधिकारी। इस ऊतक विशिष्टता ऊतक विशेष मरम्मत, भी मानव गुर्दे के भीतर में परिणाम हो सकता है। हम पहले से पता चला कि मानव गुर्दे पीएससी (kPSCs) bmMSCs इस क्षमता नहीं है, जबकि गुर्दे की उपकला घाव को बढ़ाया है। इसके अलावा, kPSCs गुर्दे की चोट में vivoउन्नति कर सकते हैं। इसलिए, kPSCs सेल थेरेपी, किडनी के रोग और गुर्दे प्रत्यारोपण के लिए विशेष रूप से के लिए एक दिलचस्प स्रोत का गठन। यहाँ हम पूरे अंग वृक्क धमनी और संवर्धन के लिए NG2 perivascular मार्कर के माध्यम से पाचन एंजाइमों के छिड़काव पर आधारित मानव गुर्दे प्रत्यारोपण-ग्रेड से kPSCs के लिए विस्तृत अलगाव और संस्कृति विधि दिखाएँ। इस तरह, बड़े सेल मात्रा कि सेलुलर चिकित्सा के लिए उपयुक्त हैं प्राप्त किया जा सकता।

Introduction

Mesenchymal Stromal कोशिकाओं (MSCs) को प्रतिरक्षा modulatory कोशिकाओं को अस्थि मज्जा से मूल रूप से अलग किए गए हैं। वे अपनी धुरी आकारिकी, वसा, अस्थि और उपास्थि, और प्लास्टिक के पालन में अंतर करने की क्षमता के आकार द्वारा विशेषता हैं। MSCs stromal मार्करों CD73, CD90, CD105 ऋणात्मक मार्करों CD31 और CD45^1,2,3के लिए किया जा रहा करते समय व्यक्त करते हैं। MSCs उनके ऊतक homeostatic और प्रतिरक्षण निश्चायक क्षमता के कारण सेल थेरेपी के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार हैं। bmMSCs वर्तमान में किडनी के रोगों और किडनी प्रत्यारोपण के रूप में कहीं और⁴की समीक्षा सहित कई रोगों के लिए नैदानिक परीक्षणों में अध्ययन किया जा रहा हैं।

पहले यह दिखाया था कि वसा ऊतकों सहित कई विभिन्न ठोस अंगों से, perivascular कोशिकाओं, नाल और कंकाल की मांसपेशी के साथ MSCs⁹विशेषताओं का हिस्सा। हालांकि, इन कोशिकाओं के भी ऊतक-विशिष्ट कार्य करता है जो organotypic मरम्मत¹⁰में परिणाम कर सकते हैं प्रदर्शन। मानव उपयोग perivascular कोशिकाओं, उदाहरण के लिए, बाद hypoxia angiogenic प्रतिक्रियाओं उत्तेजित और perivascular कोशिकाओं के अन्य ऊतकों से अलग इन क्षमता¹¹नहीं दिखा था, जबकि cardiomyocytes में, विभेदित।

Perivascular stromal कक्ष के माउस^12,13,14 और मानव किडनी^15,16से अलग भी हो सकते हैं। हम बड़े पैमाने पर kPSCs विशेषता और bmMSCs के लिए इन की तुलना में। हमने पाया कि kPSCs, bmMSCs करने के लिए, समान immunosuppressive क्षमता है और नाड़ी जाल के गठन का समर्थन कर सकते हैं। हालांकि, सेल प्रकार, kPSCs एक organotypic transcriptional अभिव्यक्ति हस्ताक्षर, HoxD10 और HoxD11 nephrogenic प्रतिलेखन कारकों सहित दिखाया के रूप में विशिष्ट अंतरों ऊतक होते हैं। kPSCs, bmMSCs, विपरीत TGF-β के साथ उत्तेजना के बाद myofibroblast बदलाव से गुजरना नहीं किया और adipocytes में अंतर करने में असमर्थ थे। इसके अलावा, kPSCs त्वरित उपकला अखंडता एक गुर्दे की ट्यूबलर उपकला घाव खरोंच परख में, एक घटना जो bmMSCs के साथ नहीं देखा गया था। इस एन्हांस्ड घाव की मरम्मत hepatocyte वृद्धि कारक विज्ञप्ति के माध्यम से मध्यस्थता था। इसके अलावा, kPSCs तीव्र गुर्दे की चोट¹⁵का एक माउस मॉडल में गुर्दे की चोट ameliorated. इसलिए, kPSCs बेहतर गुर्दे की मरम्मत क्षमता है लगता है और किडनी के रोगों में सेल थेरेपी के लिए एक दिलचस्प नए स्रोत रहे हैं।

KPSCs सेल चिकित्सा प्रयोजनों के लिए उपयोग करने के लिए सक्षम होने के लिए, kPSCs चिकित्सीय ग्रेड एंजाइमों और प्रोटोकॉल के साथ एक नैदानिक ग्रेड तरीके से पृथक होना चाहिए। इसके अलावा, 1 दाता से kPSCs के साथ कई रोगियों का इलाज करने में सक्षम होना करने के लिए पर्याप्त कक्ष संख्या प्राप्त की जानी चाहिए। यहाँ हम विस्तार में, चिकित्सीय ग्रेड अलगाव की प्रक्रिया पूरे प्रत्यारोपण ग्रेड गुर्दे, से kPSCs का नैदानिक सेलुलर चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए कक्षों की पर्याप्त संख्या उपज दिखाएँ।

Protocol

The local medical ethical committee and ethical advisory board of the European consortium (STELLAR) approved the research and collection of human transplant grade kidneys discarded mainly for surgical reasons. Research consent was given for all kidneys. 1. Preparations for Cell Culture Prepare a pool of platelet lysates. Store the platelets that have expired for less than 2 d in -80 °C until use (for a maximum of 1 year). NOTE: The platelets were originally sourced from a commercial vendor. Hospital surplus material distributed by the local blood bank were obtained. Thaw the platelets of at least 5 donors (preferably 10) O/N at 4 °C. Pool the platelets in a large sterile bottle, transfer to conical centrifuge tubes and spin down for 10 min at 1,960 x g at 4 °C. NOTE: The volume of platelets depends on the number of donors and the amount of hospital surplus material per donor. Pipette the supernatant to blood bags (50 mL/bag) through the barrel of a 50 mL syringe. Store at -80 °C. Preparation of cell culture medium. Defrost one bag of platelet lysates in a water bath at 37 °C. Add 1 L (i.e. 2 bottles) of Minimum Essential Medium – alpha modification (alphaMEM), 5 mL 200 mM glutamine, and 20 mL of penicillin (5,000 U/mL)/streptomycin (5,000 µg/mL) (pen/strep) to the bag. Incubate for 3 h at 37 °C. Shake the bag for degelling by gently tapping on the bag when the bag is resting on a flat surface. Filter the 5% platelet lysates medium by pulling the lysates through the filter of the transfusion system with a sterile 50 mL syringe. Aliquot the medium in 50 mL tubes and store in -80 °C until use. NOTE: Every new batch of platelet lysates is tested in cell culture and compared to the previous batch by growing cells of interest (bmMSCs or kPSCs) to confluency in both batches. In cell numbers and viability, the kPSCs or bmMCs grown in the new batch should not differ more than 10%, and the marker expression of CD73, CD90, CD105 and CD31, CD34 and CD45 as analyzed by flow cytometry should not differ. The methods of cell culture are described in section 6 of the protocol (Culture of kPSC). 2. Preparations for Cell Harvest Preparation of solutions. Prepare the plain medium by adding 10 mL of pen/strep to 500 mL (1 bottle) of Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM)-F12. Prepare the washing medium by adding 50 mL of Normal Human Serum (NHS) and 10 mL of pen/strep to 1 bottle of DMEM-F12. Prepare the enzyme-stock buffer by adding 2.9 mL 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1.2 mL NaHCO3 2.5% [w/v] and 160 µL CaCl2 (1 M) to 160 mL University of Wisconsin solution. Prepare the collagenase solution by slowly adding 20 mL of enzyme stock buffer to the bottle of GMP-grade collagenase containing >2,000 U/bottle collagenase. Dissolve at 4 °C for approximately 40 min. Gently shake several times during the dissolving period. Prepare the freeze medium by adding 5 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) to 45 mL NHS. Preparation of perfusion tray (Figure 1A). Clean the flow cabin and cover with surgical drapes. Heat a water bath to approximately 40 – 45 °C to heat the perfusion tray to 37 °C. Put on surgical gowns and surgical gloves. Connect a sterilized perfusion tray to the water bath to preheat the perfusion tray with warm water. Make sure that there is no air in the perfusion tray by starting with the perfusion tray in the vertical position. If necessary add more water to the water bath to prevent air infusion into the perfusion tray. Place the LS25 tube in the pump. Leave both sterile ends of the tube in the flow cabinet. Place a Kocher's forceps on one end of the tube and allow to rest on the bottom of the perfusion tray. Place a sterile gauze on top of the tube to prevent obstruction. Attach a Luer connector on the other tube end. Add approximately 100 mL of plain medium into the perfusion tray and start flushing the tube on a pump speed of 100 mL/min. 3. Kidney Cell Isolation Preparation of the kidney. Remove the kidney from the double sterile bags and place on the sterile perfusion tray (Figure 1B). Remove the perirenal adipose tissue and kidney capsule with scissors and gentle tearing (Figure 1C) and identify the renal artery on the aortic patch as shown in Figure 1D. Cannulate the renal artery with the accessory spike, fix with a sterilized tie-rip, and attach to the pump tube end with the Luer connector while the pump is on. If the tubes are not completely filled, first add more medium to the tray and flush tubes by starting the pump (Figure 1E – F). Flush the kidney with plain medium via the pump with a flow of 100 mL/min. Collagenase treatment and kidney cell isolation. Add collagenase (20 mL, >2,000 U) and DNase (2.5 mL, 1 mg/mL) to the perfusion tray (Figure 1G). Turn the kidney from time to time gently by hand. Wait until the kidney becomes soft and the perfusion liquid becomes less transparent (approximately 30 – 40 min). Gently massage the kidney (Figure 1H) until a cell suspension is obtained (Figure 1I). Remove non-digested material and the spike in the renal artery. Washing and collection of kidney cells. Add 50 mL of the NHS to the cell suspension. Drain the cell suspension from the perfusion tray by putting the pump at low flow and placing the tube first connected to the kidney above the 50 mL tubes (Figure 1J). Centrifuge at 300 x g for 7 min at 4 ˚C and remove the supernatant. Wash the pellets with washing medium containing 10% NHS and again centrifuge at 300 x g for 7 min. Repeat washing once more. Measure the volume of the cell pellets and add an equal volume of cell culture medium. Either cryopreserve the cells from here by adding freezing medium 1:1 to the cell suspension and store in cryogenic vials according to standard protocols, or continue to culture the cells (section 4). NOTE: The cell suspension contains cell clumps and requires extra steps to obtain single cells, which results in an increase in cell death. Therefore, the cells are kept in suspension and are not counted at this stage. 4. Cell Culture of Crude Kidney Cells Add approximately 1 mL of the cell suspension to 24 mL of alphaMEM 5% platelet lysates (cell culture medium) in a T175 cell culture flask (Figure 1K) and culture at 37 °C, 5% CO2. Remove the medium and cell debris after 2 d from the adherent cells and refresh the medium with 25 mL of cell culture medium. Refresh the culture medium twice a week by removing half of the medium (12.5 mL) and adding fresh medium (12.5 mL) using aseptic techniques. Culture until confluent (usually 5 – 7 d) (Figure 1L). Remove the medium, wash twice with PBS and trypsinize the cells by adding 5 mL trypsin to each T175 flask for 5 min at 37 °C. Wash in culture medium and centrifuge at 490 x g for 5 min and remove the supernatant. 5. Cell Enrichment for NG2 by Magnetic Cell Separation (Figure 1M) Prepare the cell separation buffer according to manufacturer's protocol. Resuspend the trypsinized kPSCs in 10 mL cell separation buffer. Centrifuge at 490 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the cells in 300 µL cell separation buffer. Add 100 µL FcR blocking reagen/5 x 107 cells, add 100 µL anti-melanoma (NG2) beads per 5 x 107 cells, and incubate for 30 min at 4 °C. Separate the NG2-positive fraction according to manufacturer's protocol. Add 10 mL of medium and centrifuge cells for 5 min at 490 x g. Count the cells using a Bürker counting chamber according to manufacturer's protocol. Seed the cells in a culture flask (approximately 4 x 103 cells/cm2) and incubate. NOTE: Seed the cells in the following concentrations: <250,000 in a T25 flask, 250,000 – 500,000 in a T75 flask, and 700,000 – 800,000 in a T175 flask. After magnetic cell enrichment, a positive fraction of approximately 1 – 2% is isolated. However, as this step is cell enrichment and not cell sorting, other cell types will be present in the culture (Figure 1N). After several passages (usually around 4 – 5), only a homogenous kPSC-population is present (Figure 1P). 6. Culture of kPSCs Refresh the medium twice a week by removing half of the medium and replace it with freshly thawed culture medium (Figure 1N). NOTE: The kPSCs tend to be more viable and proliferative when only half of the medium is refreshed. Passaging of kPSCs. NOTE: Passage the kPSCs at either 90 – 100% confluency, or when 3D structures appear (see Figure 1O), or when there hasn't been cell growth for more than a week. The latter two particularly might occur at early passages after cell enrichment. In this case, after passaging, the cells will usually start to grow again in monolayer culture (Figure 1P). Remove the medium from the 90 – 100% confluent cells (keep the medium for later use). Wash the flask twice with PBS (1 mL in T25, 5 mL in T75, 10 mL in T175). Add trypsin (0.5 mL in T25, 2 mL in T75, 5 mL in T175) and incubate for 5 min at 37 °C. Add the old medium to the flask and resuspend gently. Transfer to a 15 or 50 mL tube (depending on the volume) and centrifuge at 490 x g for 5 min. Count the viable cells and plate <250,000 in a T25, 250,000 – 500,000 in a T75, or 700,000 – 800,000 in a T175 (approximately 4 x 103 cells/cm2). Test the kPSCs at passage 5 or 6 (e.g., scratch assay, section 7). NOTE: Characterize the propagated cells by flow cytometry using standard protocols. Marker expression of NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC should all be positive and CD31, CD34, CD45 and HLA-DR should be negative. Test for mycoplasma, bacteria and fungi in the culture medium according to standard protocols of the clinical microbiology lab. Test the kPSCs functionally in a kidney epithelial wound scratch assay. Experiments are usually performed with sterile, flow cytometry-confirmed homogeneous kPSC populations with wound healing capacity between passage 6-8. Cryopreserve the kPSCs by adding 0.5 mL cryopreservation medium to 0.5 mL cell suspension (2 million cells per mL of culture medium) using standard protocols. NOTE: After thawing, seed the kPSCs at a higher density (106 cells in a T175). 7. Functional Test of kPSCs: Kidney Epithelial Wound Scratch Assay Culture the kPSCs in a 6-well plate at a density of 200,000 cells/well in 2 mL culture medium. After 48 h of culture at 37 °C, 5% CO2, collect the supernatant. This is the conditioned medium. Seed the HK-2 (proximal tubular epithelial cells)17 in 2 mL of Proximal Tubular Epithelial Cell (PTEC) medium consisting of a 1:1 ratio of DMEM-F12 supplemented with insulin (5 mg/mL), transferrin (5 mg/mL), selenium (5 ng/mL), hydrocortisone (36 ng/mL), triiodothyrinine (40 pg/mL), epidermal growth factor (10 ng/mL) and pen/strep, in a density of 500,000 cells per well in a 6-well cell culture plate. Culture for 48 h at 37 °C, 5% CO2. Remove the cell culture medium of the HK-2s and create a scratch wound in the monolayer of HK-2s by making a scratch with the tip of a yellow pipette point from the top to the bottom of the well. Wash the HK-2s with PBS and add the conditioned medium of the kPSCs or control medium. Mark on the bottom of the plate the area to be imaged. NOTE: The HK-2s should be confluent. Image two areas per well. Image the scratch at 4, 8, 12 and 24 h at the same marked position with an inverted bright-field microscope. Measure the scratch area in Image J using the polygon selection tool to determine the percentage of closure.

Representative Results

चिकित्सीय ग्रेड kPSCs अलगाव विधि चित्र 1में संक्षेप है। कच्चे तेल गुर्दे की कोशिकाओं से मानव प्रत्यारोपण ग्रेड गुर्दे collagenase छिड़काव द्वारा अलग कर रहे हैं। परिणामी सेल सस्पेंशन में 5% प्लेटलेट lysates confluent तक सभ्य है। उसके बाद perivascular stromal सेल अंश अलग NG2 अभिव्यक्ति पर आधारित है। kPSCs प्लास्टिक के अनुयायी धुरी के आकार का कक्ष (चित्रा 2A) हैं और stromal मार्करों CD73, CD90, CD105 और perivascular मार्कर NG2, PDGFR-बी और CD146, CD31, CD34, CD45 और एचएलए-डॉ (चित्रा 2बी) के लिए नकारात्मक जबकि के लिए सकारात्मक हैं। आमतौर पर, kPSCs के एक सजातीय जनसंख्या 4 मार्ग पर पहुंचा जा सकता और kPSCs senescence 9-10 (चित्रा 2सी) के पारित होने के आसपास तक पहुँचने। हम इसलिए यात्रा 5-8 के बीच प्रयोगों को करने के लिए सलाह है। हम पहले से पता चला कि वातानुकूलित मध्यम kPSCs की उपकला घाव भरने में यह खरोंच परख15तेज कर सकते हैं के रूप में पृथक kPSCs की कार्यात्मक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, हम एक इन विट्रो में गुर्दे की उपकला घाव खरोंच परख kPSCs, के हर नए बैच पर करते हैं। KPSC वातानुकूलित मध्यम kPSCs alphaMEM 5% प्लेटलेट lysates में 48 घंटे के लिए संवर्धन और तैरनेवाला का संग्रह द्वारा किया जाता है। अगला, अमर मानव गुर्दे की समीपस्थ tubule उपकला कोशिकाओं (एच-2)17 तक confluent सुसंस्कृत हैं और फिर एक खरोंच घाव किया जाता है। फिर या तो kPSCs या नियंत्रण माध्यम की वातानुकूलित माध्यम कुओं को जोड़ा जाता है और घाव भरने की गति मापा जाता है। जब kPSCs के वातानुकूलित माध्यम है जोड़ा गया है, घाव काफी तेजी से (चित्रा 2D) बंद कर देता है। चित्रा 1 : नैदानिक ग्रेड अलगाव विधि से मानव kPSCs. प्रत्यारोपण ग्रेड गुर्दे cannulated और वृक्क धमनी (A – G) के माध्यम से collagenase के साथ perfused कर रहे हैं और परिणामस्वरूप सेल सस्पेंशन धोया जाता है और या तो हिमिकृत या संस्कृति (H – K) में डाल दिया। Confluency (L) कोशिकाओं तक पहुँचने के बाद, कोशिका संवर्धन है NG2 (M) प्रदर्शन किया। कक्षों या तो confluent, जब वे trypsinized हैं proliferating या जब 3 डी संरचनाओं (N – P) दिखाई देते हैं बंद कर दिया है। KPSCs के लिए रिलीज़ मापदंड बाँझपन, मार्कर अभिव्यक्ति और क्षमता (Q) ट्यूबलर उपकला घाव भरने को बढ़ाने के लिए कर रहे हैं। तीर: वृक्क धमनी। पैमाने पर पट्टी 200 माइक्रोन. = कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 2: मानव का चरित्र चित्रण kPSCs . एक) kPSCs-धुरी के आकार, प्लास्टिक के अनुयायी कोशिकाओं रहे हैं। B) kPSCs mesenchymal मार्करों CD73, CD90, CD105, perivascular मार्करों NG2, PDGFR-β और CD146, CD31, CD34 और CD45 के लिए नकारात्मक जबकि के लिए सकारात्मक हैं। kPSCs एक्सप्रेस MHC वर्ग मैं (एचएलए-एबीसी) लेकिन नहीं वर्ग II (एचएलए-DR)। C) विकास विशेषताएं प्रवाह cytometry से तीन अलग अलग kPSC दाताओं के सजातीय NG2 सकारात्मक आबादी (पर पारित 4) की पुष्टि की। kPSCs senescence पारित होने के 9-10 के आसपास तक पहुँचने। D) kPSCs एक घाव खरोंच परख में गुर्दे की उपकला मरम्मत को बढ़ाने में सक्षम हैं। प्रतिनिधि चित्र नियंत्रण मध्यम और टी में वातानुकूलित kPSC मध्यम = 0, 4, 8 और 12 ज दिखाए जाते हैं। A में पैमाने पर पट्टी) = D में 200 माइक्रोन) 100 माइक्रोन. = कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

Perivascular कोशिकाओं अग्न्याशय, वसा, उपास्थि और गुर्दे की^9,15,16सहित कई अलग अलग मानव ठोस अंगों से पृथक कर दिया गया है। अधिकांश विधियों, तथापि, ऊतक है, जो dissected है और बाद में पाचन एंजाइमों के साथ इलाज किया कर रहे हैं छोटे नमूनों पर आधारित हैं। इसके अलावा, यह आम तौर पर चिकित्सीय ग्रेड के उत्पादों के साथ नहीं की गई है। यह इन रणनीतियों प्रत्यक्ष नैदानिक अनुवाद के लिए कम उपयुक्त जहां चिकित्सीय ग्रेड कक्षों की एक बड़ी मात्रा आवश्यक हैं बनाता है।

यहाँ हम एक उपन्यास अलगाव विधि मानव kPSCs के पूरे अंगों के आधार पर चिकित्सीय ग्रेड एंजाइमों और सामग्री के साथ छिड़काव के लिए दिखा। प्रोटोकॉल नैदानिक लेंगर्हंस के आइलेट अलगाव प्रोटोकॉल वर्तमान में हमारे केंद्र¹⁸में नैदानिक अनुप्रयोग के उपयोग से अनुकूलित है।

यह पहला नैदानिक ग्रेड पद्धति जहाँ kPSCs की एक बड़ी मात्रा प्राप्त किया जा सकता है। विभिन्नता सेल में काफी हद तक निर्भर दाता है। जब हम वर्तमान में तीन विभिन्न दानदाताओं के कच्चे तेल सेल निलंबन का एक अंश से प्राप्त सेल उपज extrapolated है, सिद्धांत रूप में, तथापि, एक औसत उपज 10¹² kPSCs दाता प्रति x 2.7 के प्राप्त किया जा सकता। के रूप में एमएससी थेरेपी आमतौर पर 1-2 10⁶ कक्षों/kg शरीर वजन⁴एक्स के साथ 2 कोशिका आधान के होते हैं, ये सेल संख्या निर्वाचित रोगियों के उपचार के कई के लिए पर्याप्त हैं।

Collagenase पाचन की अवधि आइसोलेशन प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। पाचन की अवधि भी कम है, जब बड़े clumps ऊतक के, जो संस्कृति करने के लिए कठिन हो जाएगा रहेगा। जब छिड़काव की अवधि बहुत लंबी है, बढ़ी हुई कोशिका मृत्यु मनाया जा सकता है। इसलिए, जैसे ही गुर्दे शीतल और कम पारदर्शी तरल पदार्थ बनने के लिए शुरू होता है, गुर्दे धीरे मालिश की जानी चाहिए और collagenase उपचार को रोका जाना चाहिए।

एक और महत्वपूर्ण कदम NG2 कोशिका संवर्धन के बाद कक्षों की संस्कृति है। NG2 कोशिका संवर्धन के बाद कभी-कभी, perivascular कक्षों पैदा करना या 3 डी संरचनाओं में विकसित करने के लिए प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ नहीं करते। जब कक्ष trypsinized और reseeded हैं, इस स्थिति में, कोशिकाओं आम तौर पर monolayer संस्कृति में विकसित करने के लिए शुरू कर देंगे।

सामग्री शुरू करने के रूप में, मानव प्रत्यारोपण ग्रेड गुर्दे शल्य चिकित्सा कारणों के लिए मुख्य रूप से छोड़ दिए थे। इन कार्यात्मक अंग प्रमुख फाइब्रोसिस के बिना कर रहे हैं। हम स्वीकार करते हैं कि यह एक अपेक्षाकृत दुर्लभ है के रूप में यह एक सीमा हो सकता है और अंग स्रोत प्राप्त करने के लिए मुश्किल। Explanted गुर्दे एक और स्रोत हो सकता है; हालांकि, गुर्दे की explantation के कारण, के आधार पर इन गुर्दे अधिक फाइब्रोसिस और इस प्रकार myofibroblasts हो सकता है, और के बाद से myofibroblasts अलग हो सकता है और perivascular कक्षों के बजाय सुसंस्कृत इसलिए ध्यान रखा जाना चाहिए।

अलग kPSCs के रूप में इस प्रोटोकॉल शो के साथ गुर्दे की उपकला के साथ organo-typic गुण घाव चिकित्सा क्षमता¹⁵, किडनी के रोग में kPSCs के साथ सेल थेरेपी और प्रत्यारोपण एक दिलचस्प भविष्य अनुप्रयोग होगा। इस उद्देश्य के लिए, कक्ष/सेल उत्पाद वितरण के कई रणनीतियों रहे हैं। पहली रणनीति IV अर्क kPSCs, के रूप में वर्तमान में bmMSC नैदानिक अध्ययन में प्रयोग किया जाता है। एक और दिलचस्प आवेदन kPSCs या प्रत्यारोपण से पहले मशीन छिड़काव में kPSC-उत्सर्जित कारकों का उपयोग है। इस तरह, जो प्रत्यारोपण के बाद बेहतर गुर्दे समारोह करने के लिए नेतृत्व कर सकते explanted गुर्दे की गुणवत्ता में सुधार हो सकता है। दोनों रणनीति के लिए, kPSCs और नैदानिक प्रयोजनों के लिए अन्वेषण करें करने के लिए एक दिलचस्प नए सेल स्रोत हैं।

Materials

Baxter bags	Fenwal	R4R-7004
Human platelets	Sanquin		hospital surplus material expired for less than 2 days is used
platelet lysate			custom made
Disposable sterile bottles	Corning	09-761-11
500ml PP centrifuge tubes	Corning	431123
a-MEM medium	Lonza	BE12-169F
glutamax	thermo fisher	35050038
pen/strep	Invitrogen	15070063
transfusion system	Codan	455609
DMEM-F12	life technologies	11320-074
normal human serum	Sanquin
Hepes 1M	Lonza	BE-17-737E
NaHCO3 7.5%	Lonza	BE17-613E
CaCl2 1M	Sigma-Aldrich	10043-52-4
UW	Bridge to life	32911
Heparin	Leo Pharma
collagenase NB1 GMP grade	SERVA	17455.03
DMSO	Sigma Aldrich	D2650-100ml
surgical drapes	3M Nederland	DH999969404
perfusion pump	metrohm	x007528300
pump head	metrohm	x077202600
perfusion tray			custom made
LS25 masterflex tubes	Masterflex	HV-96410-25
accessory spike	Gambro DASCO	6038020
pulmozyme	Roche
culture flasks 25 cm2	greiner	690175
culture flask 75 cm2	greiner	658170
culture flask 175 cm2	greiner	661160
Trypsin	sigma	t4174
BSA	Sigma	A2153
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500g
FcR blocking reagent	miltenyi	130-059-901
anti melanoma beads (NG2)	miltenyi	130-090-452
cellstrainer 70 µm	Corning	352350
LS columns	Miltenyi	130-042-401
MACS magnet	miltenyi	130-090-976
CD34 FITC	BD	555821
CD45 APC	BD	555485
CD146 PE	BD	550315
NG2 APC	R&D	FAB2585A
CD90 PE	BD	555596
HLA ABC APC	BD	555555
CD105 FITC	Ancell	326-040
HLA DR APC	BD	559866
CD56 PE	BD	555516
CD73 PE	BD	550257
CD31 FITC	BD	555445
CD133 PE	miltenyi	130-090-853
PDGF-r	R&D	mab 1263
mouse IgG1 FITC	BD	345815
mouse IgG1 PE	BD	345816
mouse IgG1 APC	BD	345818
IgG2b PE	BD	555743
goat anti mouse PE	Dako	R0480
sodium azide	Merck	822335
DMEM Ham’s F12	Gibco	31331-028
ITS (insul, transferrin, selenium)	Sigma	I1884
hydrocortisone	Sigma	H0135
triiodothyrinine	Sigma	T5516
epidermal growth factor	sigma	E9644
Immortalized human renal PTEC (HK2)			courtesey of M. Ryan, university college Dublin