여기 우리는 신장 혈관 주위 Stromal 세포 (kPSCs) 소화 효소와 NG2 셀 농축 전체가 장기 관류에 따라 새로운 임상 등급 고립과 문화 방법 제시. 이 방법으로 세포 치료에 대 한 충분 한 셀 번호 취득 가능 하다.
Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs)는 조직 항상성 및 면역 modulatory 세포 신장 질환과 이식에 유익한 효과 표시. 혈관 주위 Stromal 세포 (PSCs) 골 MSCs (bmMSCs)와 특성을 공유. 그러나, 그들은 또한 소유, 대부분 지역 각 인, 조직 관련 속성 및 지역 조직의 항상성에서 역할. 이 조직 특이성 또한 인간의 신장 내 조직 특정 복구 될 수 있습니다. 우리는 이전 인간의 신장 Psc (kPSCs)는 신장 상피 상처 치유 bmMSCs이이 잠재력 하지 않은 반면 강화 보였다. 또한, kPSCs는 신장 상해 비보개량 수 있습니다. 따라서, kPSCs는 특히 신장 질환과 신장 이식에 대 한 세포 치료에 대 한 재미 있는 소스를 구성합니다. 여기 우리가 인간의 신장 신장 동맥 및 혈관 주위 마커 NG2 농축을 통해 소화 효소의 전체 장기 관류에 따라 이식-학년에서 kPSCs에 대 한 자세한 고립과 문화 메서드를 보여줍니다. 이 방법에서는, 큰 셀 수량 얻어질 수 있다 세포 치료에 적합 합니다.
Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs)는 면역 modulatory 세포는 골 수에서 원래 고립 되었다. 그들은 그들의 스핀 들 모양의 형태, 지방, 뼈와 연골, 그리고 플라스틱 부착으로 차별 하는 능력에 의해 특징. MSCs stromal 마커 CD73, CD90, CD105 동안 마커 CD31, CD451,2,3에 대 한 부정적인 표현 한다. MSCs는 그들의 조직의 항상성 및 immunomodulatory 용량 세포 치료에 대 한 유망한 후보. bmMSCs는 현재 신장 질환과 신장 이식으로4다른 검토를 포함 하 여 여러 가지 질병에 대 한 임상 실험에서 공부 되 고 있습니다.
이전 그것은 혈관 주위 지방 조직을 포함 하 여 여러 다른 단단한 장기에서 세포, 태 반 및 골격 근육 MSCs9특성을 공유 표시 했다. 그러나,이 세포는 또한 조직 관련 기능 organotypic 수리10귀 착될 수 있는 전시. 예를 들어 인간의 심근 혈관 주위 세포 hypoxia 후 신생 응답을 자극 하 고 혈관 주위 세포가 다른 조직에서 고립이 후보11보여주지 않았다 하는 동안, cardiomyocytes에 분화.
혈관 주위 stromal 세포 마우스12,,1314 및 인간의 신장15,16으로부터 격리 될 수 있습니다. 우리는 광범위 하 게 kPSCs를 특징 하 고 bmMSCs에 비해. 우리는 kPSCs, bmMSCs, 유사한 면역 능력 있고, 혈관 신경 얼 기 형성을 지원할 수 있습니다 발견. 그러나, 조직 세포 유형 HoxD10 및 HoxD11 nephrogenic 전사 인자를 포함 하 여 organotypic transcriptional 식 서명 했다 kPSCs로 구체적인 차이가 있습니다. kPSCs, bmMSCs, 달리 myofibroblast 변환 후 TGF-β와 자극을 받아야 하지 않았다 고 adipocytes에 차별화 하지 못했습니다. 또한, kPSCs는 신장 관 상피 상처 스크래치 분석 결과, bmMSCs와 관찰 하지 현상은 상피 무결성 가속. 이 향상 된 상처 복구 hepatocyte 성장 인자 자료를 통해 중재 했다. 또한, kPSCs ameliorated 급성 신장 상해15의 쥐 모델에서 신장 상해. 따라서, kPSCs 우수한 신장 수리 능력을가지고 것과 신장 질환의 세포 치료에 대 한 흥미로운 새로운 소스.
세포 치료 목적을 위해 kPSCs를 사용할 수 있어야 kPSCs 임상 등급 효소와 프로토콜 임상 등급 방식으로 격리 한다. 또한, 1 기증자에 게 서 kPSCs와 여러 환자를 치료 수 있도록, 충분 한 셀 숫자를 얻은 합니다. 여기 우리가 임상 세포 치료에 사용 되는 셀의 충분 한 숫자 저조한 전체 이식 학년 신장에서 kPSCs의 임상 등급 격리 절차 자세히 보여줍니다.
혈관 주위 세포는 많은 다른 인간 단단한 장기, 췌 장, 지방, 연골, 신장9,,1516등에서 분리 되었습니다. 그러나 대부분의 방법은,, 기반으로 조직, 해 부 되 고 이후에 소화 효소 치료의 작은 샘플 합니다. 또한, 이것은 일반적으로 수행 되지 않습니다 임상 학년 제품. 이것은 이러한 전략 직접 임상 번역을 위해 보다 적게 적당 한 임상 등급 셀의 대량은 필요 합니다.
여기 우리는 관류 임상 등급 효소와 재료에 따라 전체 기관에 대 한 인간 kPSCs의 소설 격리 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 현재 우리의 센터18에 임상 응용 프로그램에 대 한 사용에에서 임상 독도 Langerhans 격리 프로토콜에서 적응.
이것은 첫 번째 임상 등급 방법 kPSCs의 대량을 달성 될 수 있다입니다. 셀 수익률의 변동성은 크게 기증자 의존. 그러나, 이론적으로, 우리는 현재 3 명의 다른 기증자의 조 세포 현 탁 액의 일부분에서 얻을 셀 생산량 추정 때 기증자 당 1012 kPSCs x 2.7의 평균 수익률 달성 될 수 있습니다. MSC 치료는 일반적으로 1-2 106 셀/kg 몸 무게4x 2 셀 혼합 이루어져 있다로이 핸드폰 번호 allogenic 치료의 여러 환자에 대 한 충분 한 있습니다.
분리 절차의 하나의 중요 한 단계는 콜라 소화의 기간입니다. 소화 기간이 너무 짧은 때 문화에 더 있을 것 이다 조직의 큰 덩어리 유지 됩니다. 관류 기간이 너무 긴 경우 증가 세포 죽음을 관찰할 수 있습니다. 따라서, 최대한 빨리 신장 부드럽고 덜 투명 한 체액 되기 시작, 신장 부드럽게 마사지 한다 고 콜라 치료를 중지 합니다.
또 다른 중요 한 단계 NG2 셀 농축 후 셀의 문화입니다. 가끔 NG2 셀 농축 후 혈관 주위 세포 증식 또는 3 차원 구조에 성장 하기 시작 시작 되지 않습니다. 이 경우 셀 trypsinized을 다시 시드해야 하는 경우 셀 것 이다 일반적으로 단층 문화에서 성장 시작 됩니다.
자료를 시작으로 인간 이식 학년 신장 수술 이유로 주로 삭제 사용 되었다. 이러한 주요 섬유 증 없이 기능적인 기관 이다입니다. 우리는 이것이 비교적 드문이 제한 있을 인정 및 기관 소스를 얻기 어렵다. Explanted 신장 있을 다른 소스; 그러나, 신장 explantation의 이유에 따라 이러한 신장에 더 많은 섬유 증 및 따라서 myofibroblasts, 포함 될 수 있습니다 그리고 그러므로 주의 해야 myofibroblasts 수 있습니다 격리 하 고 혈관 주위 세포 대신 교양.
kPSCs 절연이 프로토콜 표시와 함께 신장 상피와 유기 전형적 속성 상처 치유 용량15, 신장 질병에서 kPSCs와 세포 치료 하 고 이식 미래 응용 될 것 이다. 이 목적을 위해 셀/제품 배달의 여러 전략 있습니다. 첫 번째 전략은 bmMSC 임상 연구에서 현재 사용 되는 kPSCs의 IV 주입 이다. 또 다른 흥미로운 응용 프로그램은 kPSCs 또는 kPSC 배설 요소 이식 하기 전에 기계 관류에의 사용 이다. 이 방법으로 이식 후 향상 된 신장 기능을 이어질 수 explanted 신장의 품질 향상 됩니다. 두 전략에 대 한 kPSCs는 추가 임상 목적을 위해 탐구 하는 재미 있는 새로운 셀 소스입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 부여 계약 번호 305436에서 유럽 공동체의 일곱 번째 기구 프로그램 (FP7 2007-2013 년)에서 자금 지원을 받은 스텔라.
Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 days is used | |
platelet lysate | custom made | ||
Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
500ml PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
transfusion system | Codan | 455609 | |
DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
normal human serum | Sanquin | ||
Hepes 1M | Lonza | BE-17-737E | |
NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
CaCl2 1M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
UW | Bridge to life | 32911 | |
Heparin | Leo Pharma | ||
collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
pump head | metrohm | x077202600 | |
perfusion tray | custom made | ||
LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
pulmozyme | Roche | ||
culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
Trypsin | sigma | t4174 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
cellstrainer 70 µm | Corning | 352350 | |
LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
CD34 FITC | BD | 555821 | |
CD45 APC | BD | 555485 | |
CD146 PE | BD | 550315 | |
NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
CD90 PE | BD | 555596 | |
HLA ABC APC | BD | 555555 | |
CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
HLA DR APC | BD | 559866 | |
CD56 PE | BD | 555516 | |
CD73 PE | BD | 550257 | |
CD31 FITC | BD | 555445 | |
CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
IgG2b PE | BD | 555743 | |
goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
sodium azide | Merck | 822335 | |
DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
ITS (insul, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
epidermal growth factor | sigma | E9644 | |
Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |