En roman kliniska Grade isolering metod för mänskliga njurar perivaskulär stromaceller

Summary

Här presenterar vi en roman kliniska grade isolering och kultur metod för njure perivaskulär stromaceller (kPSCs) baserat på hela orgel perfusion med matsmältningsenzymer och NG2-cell anrikning. Med denna metod är det möjligt att förvärva tillräcklig cell nummer för cellterapi.

Abstract

Mesenkymala stromaceller (MSCs) är vävnad homeostatiska och immun immunmodulerande celler som har visat positiva effekter i njursjukdomar och transplantation. Perivaskulär stromaceller (PSC) dela egenskaper med benmärg MSCs (bmMSCs). Dock äger de också, troligen på grund av lokala imprinting, vävnad-specifika egenskaper och spela en roll i lokal vävnadsreaktion homeostas. Detta vävnadsspecificitet kan resultera i vävnad specifika reparation, också inom den mänskliga njuren. Vi har tidigare visat att mänskliga njurar PSC (kPSCs) har förbättrat njure epitelial sårläkning medan bmMSCs inte hade denna potential. Dessutom kan kPSCs lindra njure skada i vivo. KPSCs utgör således en intressant källa för cellterapi, särskilt för njursjukdomar och njurtransplantation. Här visar vi den detaljerade isolering och kultur metoden för kPSCs från transplantation-grade mänskliga njurar baserat på hela-orgel genomblödning av matsmältningsenzymer via Njurartären och berikande för perivaskulär markören NG2. På detta sätt, kan det erhållas stora cell mängder som är lämpliga för cellterapi.

Introduction

Mesenkymala stromaceller (MSCs) är immunmodulerande immunceller som isolerades ursprungligen från benmärgen. De kännetecknas av sin spindel som formade morfologi, förmåga att differentieras till fett och brosk, ben och plast följsamhet. MSCs express stromal markörerna CD73, CD90, CD105 samtidigt vara negativa för markörer CD31 och CD45^1,2,3. MSCs är en lovande kandidat för cellterapi på grund av sin vävnad homeostatiska och immunmodulerande kapacitet. bmMSCs studeras för närvarande i kliniska prövningar för flera sjukdomar, inklusive njursjukdomar och njurtransplantation som granskat någon annanstans⁴.

Tidigare visades att perivaskulär celler från flera olika solida organ, inklusive fettvävnad, moderkakan och skelettmuskel delar egenskaper med MSCs⁹. Dock uppvisar dessa celler också vävnadsspecifika funktioner vilket kan resultera i organotypic reparation¹⁰. Mänskliga hjärtinfarkt perivaskulär celler, till exempel stimuleras angiogena Svaren efter hypoxi och differentieras efter hjärtmuskelceller, medan perivaskulär celler isolerade från andra vävnader inte visade dessa potentialer¹¹.

Perivaskulär stromaceller kan också isoleras från mus^12,13,14 och mänskliga njurar^15,16. Vi i stor utsträckning kännetecknas kPSCs och jämförde dessa till bmMSCs. Vi hittade att kPSCs, liknar bmMSCs, har immunhämmande kapacitet och kan stödja vaskulär plexus bildning. Men finns det vävnad specifika skillnader mellan celltyper, som kPSCs visade en organotypic transkriptionell uttryck signatur, inklusive de nefrogen transkriptionsfaktorerna HoxD10 och HoxD11. kPSCs, i motsats till bmMSCs, genomgå inte myofibroblast omvandling efter stimulering med TGF-β och kunde inte differentieras till adipocyter. Dessutom accelererade kPSCs epitelial integritet i en njure tubulär epitelial sår scratch test, ett fenomen som inte observerats med bmMSCs. Detta förbättrade sår reparation var medierad via hepatocyte tillväxtfaktor release. Dessutom förbättras kPSCs njurskada i en musmodell av akut njure skada¹⁵. Därför kPSCs verkar ha överlägsen nedsatt reparation kapacitet och är en intressant ny källa för cellterapi i njursjukdomar.

För att kunna använda kPSCs för cell terapi ändamål, ska kPSCs isoleras på en klinisk grade sätt med kliniska grade enzymer och protokoll. Dessutom för att kunna behandla flera patienter med kPSCs från 1 donator, bör tillräcklig cell nummer erhållas. Här visar vi i detalj, kliniska grade isolering tillvägagångssättet av kPSCs från hela transplantation grad njurarna, vilket ger tillräckligt antal celler som ska användas för kliniska cellterapi.

Protocol

The local medical ethical committee and ethical advisory board of the European consortium (STELLAR) approved the research and collection of human transplant grade kidneys discarded mainly for surgical reasons. Research consent was given for all kidneys. 1. Preparations for Cell Culture Prepare a pool of platelet lysates. Store the platelets that have expired for less than 2 d in -80 °C until use (for a maximum of 1 year). NOTE: The platelets were originally sourced from a commercial vendor. Hospital surplus material distributed by the local blood bank were obtained. Thaw the platelets of at least 5 donors (preferably 10) O/N at 4 °C. Pool the platelets in a large sterile bottle, transfer to conical centrifuge tubes and spin down for 10 min at 1,960 x g at 4 °C. NOTE: The volume of platelets depends on the number of donors and the amount of hospital surplus material per donor. Pipette the supernatant to blood bags (50 mL/bag) through the barrel of a 50 mL syringe. Store at -80 °C. Preparation of cell culture medium. Defrost one bag of platelet lysates in a water bath at 37 °C. Add 1 L (i.e. 2 bottles) of Minimum Essential Medium – alpha modification (alphaMEM), 5 mL 200 mM glutamine, and 20 mL of penicillin (5,000 U/mL)/streptomycin (5,000 µg/mL) (pen/strep) to the bag. Incubate for 3 h at 37 °C. Shake the bag for degelling by gently tapping on the bag when the bag is resting on a flat surface. Filter the 5% platelet lysates medium by pulling the lysates through the filter of the transfusion system with a sterile 50 mL syringe. Aliquot the medium in 50 mL tubes and store in -80 °C until use. NOTE: Every new batch of platelet lysates is tested in cell culture and compared to the previous batch by growing cells of interest (bmMSCs or kPSCs) to confluency in both batches. In cell numbers and viability, the kPSCs or bmMCs grown in the new batch should not differ more than 10%, and the marker expression of CD73, CD90, CD105 and CD31, CD34 and CD45 as analyzed by flow cytometry should not differ. The methods of cell culture are described in section 6 of the protocol (Culture of kPSC). 2. Preparations for Cell Harvest Preparation of solutions. Prepare the plain medium by adding 10 mL of pen/strep to 500 mL (1 bottle) of Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM)-F12. Prepare the washing medium by adding 50 mL of Normal Human Serum (NHS) and 10 mL of pen/strep to 1 bottle of DMEM-F12. Prepare the enzyme-stock buffer by adding 2.9 mL 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1.2 mL NaHCO3 2.5% [w/v] and 160 µL CaCl2 (1 M) to 160 mL University of Wisconsin solution. Prepare the collagenase solution by slowly adding 20 mL of enzyme stock buffer to the bottle of GMP-grade collagenase containing >2,000 U/bottle collagenase. Dissolve at 4 °C for approximately 40 min. Gently shake several times during the dissolving period. Prepare the freeze medium by adding 5 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) to 45 mL NHS. Preparation of perfusion tray (Figure 1A). Clean the flow cabin and cover with surgical drapes. Heat a water bath to approximately 40 – 45 °C to heat the perfusion tray to 37 °C. Put on surgical gowns and surgical gloves. Connect a sterilized perfusion tray to the water bath to preheat the perfusion tray with warm water. Make sure that there is no air in the perfusion tray by starting with the perfusion tray in the vertical position. If necessary add more water to the water bath to prevent air infusion into the perfusion tray. Place the LS25 tube in the pump. Leave both sterile ends of the tube in the flow cabinet. Place a Kocher's forceps on one end of the tube and allow to rest on the bottom of the perfusion tray. Place a sterile gauze on top of the tube to prevent obstruction. Attach a Luer connector on the other tube end. Add approximately 100 mL of plain medium into the perfusion tray and start flushing the tube on a pump speed of 100 mL/min. 3. Kidney Cell Isolation Preparation of the kidney. Remove the kidney from the double sterile bags and place on the sterile perfusion tray (Figure 1B). Remove the perirenal adipose tissue and kidney capsule with scissors and gentle tearing (Figure 1C) and identify the renal artery on the aortic patch as shown in Figure 1D. Cannulate the renal artery with the accessory spike, fix with a sterilized tie-rip, and attach to the pump tube end with the Luer connector while the pump is on. If the tubes are not completely filled, first add more medium to the tray and flush tubes by starting the pump (Figure 1E – F). Flush the kidney with plain medium via the pump with a flow of 100 mL/min. Collagenase treatment and kidney cell isolation. Add collagenase (20 mL, >2,000 U) and DNase (2.5 mL, 1 mg/mL) to the perfusion tray (Figure 1G). Turn the kidney from time to time gently by hand. Wait until the kidney becomes soft and the perfusion liquid becomes less transparent (approximately 30 – 40 min). Gently massage the kidney (Figure 1H) until a cell suspension is obtained (Figure 1I). Remove non-digested material and the spike in the renal artery. Washing and collection of kidney cells. Add 50 mL of the NHS to the cell suspension. Drain the cell suspension from the perfusion tray by putting the pump at low flow and placing the tube first connected to the kidney above the 50 mL tubes (Figure 1J). Centrifuge at 300 x g for 7 min at 4 ˚C and remove the supernatant. Wash the pellets with washing medium containing 10% NHS and again centrifuge at 300 x g for 7 min. Repeat washing once more. Measure the volume of the cell pellets and add an equal volume of cell culture medium. Either cryopreserve the cells from here by adding freezing medium 1:1 to the cell suspension and store in cryogenic vials according to standard protocols, or continue to culture the cells (section 4). NOTE: The cell suspension contains cell clumps and requires extra steps to obtain single cells, which results in an increase in cell death. Therefore, the cells are kept in suspension and are not counted at this stage. 4. Cell Culture of Crude Kidney Cells Add approximately 1 mL of the cell suspension to 24 mL of alphaMEM 5% platelet lysates (cell culture medium) in a T175 cell culture flask (Figure 1K) and culture at 37 °C, 5% CO2. Remove the medium and cell debris after 2 d from the adherent cells and refresh the medium with 25 mL of cell culture medium. Refresh the culture medium twice a week by removing half of the medium (12.5 mL) and adding fresh medium (12.5 mL) using aseptic techniques. Culture until confluent (usually 5 – 7 d) (Figure 1L). Remove the medium, wash twice with PBS and trypsinize the cells by adding 5 mL trypsin to each T175 flask for 5 min at 37 °C. Wash in culture medium and centrifuge at 490 x g for 5 min and remove the supernatant. 5. Cell Enrichment for NG2 by Magnetic Cell Separation (Figure 1M) Prepare the cell separation buffer according to manufacturer's protocol. Resuspend the trypsinized kPSCs in 10 mL cell separation buffer. Centrifuge at 490 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the cells in 300 µL cell separation buffer. Add 100 µL FcR blocking reagen/5 x 107 cells, add 100 µL anti-melanoma (NG2) beads per 5 x 107 cells, and incubate for 30 min at 4 °C. Separate the NG2-positive fraction according to manufacturer's protocol. Add 10 mL of medium and centrifuge cells for 5 min at 490 x g. Count the cells using a Bürker counting chamber according to manufacturer's protocol. Seed the cells in a culture flask (approximately 4 x 103 cells/cm2) and incubate. NOTE: Seed the cells in the following concentrations: <250,000 in a T25 flask, 250,000 – 500,000 in a T75 flask, and 700,000 – 800,000 in a T175 flask. After magnetic cell enrichment, a positive fraction of approximately 1 – 2% is isolated. However, as this step is cell enrichment and not cell sorting, other cell types will be present in the culture (Figure 1N). After several passages (usually around 4 – 5), only a homogenous kPSC-population is present (Figure 1P). 6. Culture of kPSCs Refresh the medium twice a week by removing half of the medium and replace it with freshly thawed culture medium (Figure 1N). NOTE: The kPSCs tend to be more viable and proliferative when only half of the medium is refreshed. Passaging of kPSCs. NOTE: Passage the kPSCs at either 90 – 100% confluency, or when 3D structures appear (see Figure 1O), or when there hasn't been cell growth for more than a week. The latter two particularly might occur at early passages after cell enrichment. In this case, after passaging, the cells will usually start to grow again in monolayer culture (Figure 1P). Remove the medium from the 90 – 100% confluent cells (keep the medium for later use). Wash the flask twice with PBS (1 mL in T25, 5 mL in T75, 10 mL in T175). Add trypsin (0.5 mL in T25, 2 mL in T75, 5 mL in T175) and incubate for 5 min at 37 °C. Add the old medium to the flask and resuspend gently. Transfer to a 15 or 50 mL tube (depending on the volume) and centrifuge at 490 x g for 5 min. Count the viable cells and plate <250,000 in a T25, 250,000 – 500,000 in a T75, or 700,000 – 800,000 in a T175 (approximately 4 x 103 cells/cm2). Test the kPSCs at passage 5 or 6 (e.g., scratch assay, section 7). NOTE: Characterize the propagated cells by flow cytometry using standard protocols. Marker expression of NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC should all be positive and CD31, CD34, CD45 and HLA-DR should be negative. Test for mycoplasma, bacteria and fungi in the culture medium according to standard protocols of the clinical microbiology lab. Test the kPSCs functionally in a kidney epithelial wound scratch assay. Experiments are usually performed with sterile, flow cytometry-confirmed homogeneous kPSC populations with wound healing capacity between passage 6-8. Cryopreserve the kPSCs by adding 0.5 mL cryopreservation medium to 0.5 mL cell suspension (2 million cells per mL of culture medium) using standard protocols. NOTE: After thawing, seed the kPSCs at a higher density (106 cells in a T175). 7. Functional Test of kPSCs: Kidney Epithelial Wound Scratch Assay Culture the kPSCs in a 6-well plate at a density of 200,000 cells/well in 2 mL culture medium. After 48 h of culture at 37 °C, 5% CO2, collect the supernatant. This is the conditioned medium. Seed the HK-2 (proximal tubular epithelial cells)17 in 2 mL of Proximal Tubular Epithelial Cell (PTEC) medium consisting of a 1:1 ratio of DMEM-F12 supplemented with insulin (5 mg/mL), transferrin (5 mg/mL), selenium (5 ng/mL), hydrocortisone (36 ng/mL), triiodothyrinine (40 pg/mL), epidermal growth factor (10 ng/mL) and pen/strep, in a density of 500,000 cells per well in a 6-well cell culture plate. Culture for 48 h at 37 °C, 5% CO2. Remove the cell culture medium of the HK-2s and create a scratch wound in the monolayer of HK-2s by making a scratch with the tip of a yellow pipette point from the top to the bottom of the well. Wash the HK-2s with PBS and add the conditioned medium of the kPSCs or control medium. Mark on the bottom of the plate the area to be imaged. NOTE: The HK-2s should be confluent. Image two areas per well. Image the scratch at 4, 8, 12 and 24 h at the same marked position with an inverted bright-field microscope. Measure the scratch area in Image J using the polygon selection tool to determine the percentage of closure.

Representative Results

Metoden kliniska grade kPSCs isolering sammanfattas i figur 1. Råolja njurceller isoleras från mänskliga transplantation grad njurarna av kollagenas perfusion. Resulterande cellsuspensionen är odlade tills konfluenta i 5% trombocytantal lysates. Då är andelen perivaskulär stromal cell isolerade baserat på NG2 uttryck. kPSCs är plast vidhäftande spolformad celler (figur 2A) och är positiva för stromal markörer CD73, CD90, CD105 och perivaskulär markörerna NG2, PDGFR-B och CD146, medan negativa för CD31, CD34, CD45 och HLA-DR (figur 2B). Vanligtvis en homogen population av kPSCs kan nås på passage 4 och kPSCs nå åldras runt passagen 9-10 (figur 2C). Vi rekommenderar därför för att utföra experiment mellan passage 5-8. Utvärdera den funktionella kapaciteten hos den isolerade kPSCs, utför vi ett in vitro- njure epitelial sår scratch test på varje ny omgång kPSCs, som vi tidigare visade att luftkonditionerade medlet av kPSCs kan påskynda epitelial sårläkning i denna scratch test15. KPSC luftkonditionerade medium görs genom odling kPSCs för 48 h i alphaMEM 5% trombocytantal lysates och samla in supernatanten. Nästa, de förevigade mänskliga njurar proximala tubuli epitelceller (HK-2)17 odlas tills konfluenta och sedan ett skrap sår görs. Sedan antingen luftkonditionerade medlet av kPSCs eller kontroll medium läggs till brunnarna och hastigheten på sårläkning mäts. När luftkonditionerade medlet av kPSCs läggs, stänger såret betydligt snabbare (figur 2D). Figur 1 : Kliniska Grade isolering metod för mänskliga kPSCs. Transplantation grad njurar är kanylerade och perfusion med kollagenas via renal artären (A – G) och den resulterande cellsuspensionen tvättas och antingen fryst tillstånd eller sätta i kultur (H – K). När cellerna når konfluens (L), utförs NG2 cell anrikning är (M). Celler är trypsinized när de antingen är konfluenta, har slutat frodas eller när 3D-strukturer visas (N – P). Release kriterierna för kPSCs är sterilitet, markör uttryck och förmågan att förbättra tubulär epitelial sårläkning (Q). Pil: Njurartären. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra. Figur 2: karakterisering av mänskliga kPSCs. En) kPSCs är spolformad, plast vidhäftande celler. B) kPSCs är positiva för mesenkymala markörer CD73, CD90, CD105, perivaskulär markörer NG2, PDGFR-β och CD146, medan negativa för CD31, CD34 och CD45. kPSCs express MHC-klass I (HLA-ABC) men inte klass II (HLA-DR). C) tillväxt kännetecken för tre olika kPSC givare från flödescytometri bekräftade homogen NG2 positiva populationer (på passage 4). kPSCs nå åldras runt passagen 9-10. D) kPSCs kan förbättra njure epitelial reparation i ett sår scratch test. Representativa bilder av kontroll medium och kPSC luftkonditionerade medium vid t = 0, 4, 8 och 12 h visas. Skalstapeln i A) = 200 µm, i D) = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Perivaskulär celler har isolerats från många olika mänskliga solid organ, inklusive de njure^9,15,16, bukspottkörteln, fett och brosk. De flesta metoder, bygger dock på små prover av vävnad, som är dissekeras och därefter behandlas med matsmältningsenzymer. Dessutom är detta vanligtvis inte utförs med kliniska grade produkter. Detta gör dessa strategier mindre lämplig för direkt klinisk översättning där stora mängder kliniska-grade celler behövs.

Här visar vi en roman isolering metod för mänskliga kPSCs av hela organ baserat på perfusion med kliniska grade enzymer och material. Protokollet är anpassade från det kliniska Langerhanska isolering nu protokollet för klinisk tillämpning i vårt center¹⁸.

Detta är den första kliniska grade metoden där stora mängder kPSCs kan uppnås. Variabiliteten i cell kapacitet är till stor del givare beroende. Dock när den cell avkastningen vi för närvarande erhåller från en bråkdel av den rå cellsuspensionen av tre olika givare är extrapoleras, i teorin, skulle en genomsnittsavkastning av 2.7 x 10¹² kPSCs per givare kunna uppnås. Som MSC behandling består oftast av 2 cell infusioner med 1-2 x 10⁶ celler/kg kropp vikt⁴, är dessa cell nummer tillräckliga för prövningar behandling av flera patienter.

Ett kritiskt steg i förfarandet för isolering är varaktigheten av kollagenas matsmältningen. När matsmältningen perioden är för kort, förblir stora klumpar av vävnad, som kommer att vara svårare att kultur. När perfusion är alltför lång, observeras ökad celldöd. Därför så snart som njurarna börjar bli mjuk och de mindre genomskinliga vätskorna, njuren ska masseras försiktigt och kollagenas behandlingen bör avbrytas.

Ett annat viktigt steg är en kultur av cellerna efter NG2 cell anrikning. Ibland efter NG2 cell berikning börjar perivaskulär cellerna inte föröka eller börjar växa i 3D-strukturer. I det här fallet när cellerna är trypsinized och sådd, kommer cellerna vanligtvis börjar växa i enskiktslager kultur.

Som utgångsmaterial, användes mänskliga transplantation grad njurarna kasseras huvudsakligen för kirurgiska skäl. Dessa är funktionella organ utan större fibros. Vi erkänner att detta kan vara en begränsning eftersom detta är en relativt sällsynt och svårt att få orgel källa. Explanterad njurar kan vara en annan källa; men beroende på resonera av njure explantation, dessa njurarna kan innehålla mer fibros och därmed myofibroblaster och därför bör försiktighet eftersom myofibroblaster kan vara isolerade och odlade i stället för perivaskulär celler.

Som kPSCs isolerad med detta protokoll show organo-typis boenden med njure epitelial sår läkande kapacitet¹⁵, cellterapi med kPSCs i njursjukdomar och transplantation skulle vara en intressant framtida tillämpning. För detta ändamål finns det flera strategier för cell deponicell produktleverans. Den första strategin är IV infusion av kPSCs, som används för närvarande i bmMSC kliniska studier. Ett annat intressant program är att använda kPSCs eller kPSC-utsöndras faktorer i maskinen perfusion före transplantation. På detta sätt, kan kvaliteten på explanterad njuren förbättra vilket kan leda till förbättrad njurfunktion efter transplantation. För båda strategierna är kPSCs en intressant ny cell källa att ytterligare utforska för kliniska ändamål.

Materials

Baxter bags	Fenwal	R4R-7004
Human platelets	Sanquin		hospital surplus material expired for less than 2 days is used
platelet lysate			custom made
Disposable sterile bottles	Corning	09-761-11
500ml PP centrifuge tubes	Corning	431123
a-MEM medium	Lonza	BE12-169F
glutamax	thermo fisher	35050038
pen/strep	Invitrogen	15070063
transfusion system	Codan	455609
DMEM-F12	life technologies	11320-074
normal human serum	Sanquin
Hepes 1M	Lonza	BE-17-737E
NaHCO3 7.5%	Lonza	BE17-613E
CaCl2 1M	Sigma-Aldrich	10043-52-4
UW	Bridge to life	32911
Heparin	Leo Pharma
collagenase NB1 GMP grade	SERVA	17455.03
DMSO	Sigma Aldrich	D2650-100ml
surgical drapes	3M Nederland	DH999969404
perfusion pump	metrohm	x007528300
pump head	metrohm	x077202600
perfusion tray			custom made
LS25 masterflex tubes	Masterflex	HV-96410-25
accessory spike	Gambro DASCO	6038020
pulmozyme	Roche
culture flasks 25 cm2	greiner	690175
culture flask 75 cm2	greiner	658170
culture flask 175 cm2	greiner	661160
Trypsin	sigma	t4174
BSA	Sigma	A2153
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500g
FcR blocking reagent	miltenyi	130-059-901
anti melanoma beads (NG2)	miltenyi	130-090-452
cellstrainer 70 µm	Corning	352350
LS columns	Miltenyi	130-042-401
MACS magnet	miltenyi	130-090-976
CD34 FITC	BD	555821
CD45 APC	BD	555485
CD146 PE	BD	550315
NG2 APC	R&D	FAB2585A
CD90 PE	BD	555596
HLA ABC APC	BD	555555
CD105 FITC	Ancell	326-040
HLA DR APC	BD	559866
CD56 PE	BD	555516
CD73 PE	BD	550257
CD31 FITC	BD	555445
CD133 PE	miltenyi	130-090-853
PDGF-r	R&D	mab 1263
mouse IgG1 FITC	BD	345815
mouse IgG1 PE	BD	345816
mouse IgG1 APC	BD	345818
IgG2b PE	BD	555743
goat anti mouse PE	Dako	R0480
sodium azide	Merck	822335
DMEM Ham’s F12	Gibco	31331-028
ITS (insul, transferrin, selenium)	Sigma	I1884
hydrocortisone	Sigma	H0135
triiodothyrinine	Sigma	T5516
epidermal growth factor	sigma	E9644
Immortalized human renal PTEC (HK2)			courtesey of M. Ryan, university college Dublin