本方案可实现对具有显著差异的Vibrio parahaemolyticus游动细胞和群游细胞进行单细胞显微观察。该方法能够获得易于用于单细胞分析的群游细胞群体，涵盖了细胞培养制备、群游分化诱导、样品制备以及图像分析等步骤。
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本文内容
摘要
摘要
研究蛋白质在细胞内的定位能力对于理解许多细胞过程至关重要。而实现这一目标需要能够获得单个细胞以进行荧光显微镜观察，这在对存在于细菌群落中的细胞进行成像时尤为具有挑战性。例如，人类病原体Vibrio parahaemolyticus在液体环境中以短杆状的游动细胞形式存在，当接触表面后，会分化为一类高度伸长的、专用于在固体表面生长的子群体——群集细胞。本文介绍了一种对V. parahaemolyticus在两种不同状态下的单细胞进行荧光显微镜分析的方法。该方案可高度可重复地诱导V. parahaemolyticus进入群集细胞的生活周期，并促进其在固体表面的增殖。该方法能够产生从群集菌落边缘向外延伸的分化群集细胞簇。值得注意的是，在群集簇的最尖端，群集细胞以单层形式存在，这使其能够被轻松转移至显微镜载玻片上，进而实现对单个细胞的荧光显微成像。此外，本文还展示了用于细菌群体人口学表征的图像分析工作流程。作为原理验证，文中描述了对V. parahaemolyticus游动细胞与群集细胞中趋化信号阵列的细胞内定位分析。
引言
细菌不断经历其外部环境的变化，并已进化出多种机制以相应地改变和适应其行为。其中一种机制涉及分化为不同的细胞类型，以更好地适应变化后的环境。分化过程通常伴随着细胞周期调控、细胞形态以及细胞时空组织结构的重大改变。能够发生分化的生物之一是 副溶血性弧菌. 副溶血性弧菌 属于 弧菌科，这是一类通常栖息于淡水或海水中的变形菌。 弧菌科 在环境中广泛分布，包含多种可引起人类肠道感染的物种，也包括 霍乱弧菌、副溶血性弧菌 是一种双形性生物，能够响应外界环境变化而分化为两种不同的细胞类型。在水环境中，它以短杆状的游动细胞形式存在，具有单一生长于旧细胞极的极生鞭毛。当接触表面时，会触发其向泳动细胞的分化。泳动细胞的分化过程包含两个主要变化：通过抑制细胞分裂实现泳动细胞的形态发生，以及诱导第二套鞭毛系统的生成。这导致形成周生鞭毛且高度伸长的杆状泳动细胞，该细胞可继续维持泳动生活方式（其分裂产生的子代仍为泳动细胞），或 alternatively 再次分化为游动细胞。
已有研究报道多种因素可诱导或影响泳动分化。主要刺激信号似乎源于机械感应，即副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）利用极鞭毛作为触觉传感器，当其接触表面导致旋转受阻时，可被检测到并触发分化，但还有其他多种因素参与其中1。在实验室中，可通过添加苯胺霉素（phenam....
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方案
1. 感受态细胞的制备 副溶血性弧菌 细胞及质粒DNA向游动细胞的电穿孔转染
注意：本方案的以下部分涉及电转感受态细胞的制备，以及将质粒DNA电转化至游动细胞中。如果需要在质粒上异源表达荧光蛋白，则此步骤至关重要。
- 从-80 °C甘油保藏菌种中挑取V. parahaemolyticus细胞，在含有100 µg/mL氨苄青霉素的新鲜LB琼脂平板上划线，于37 °C培养过夜。
- 次日，挑取单个V. parahaemolyticus菌落接种至200 mL LB液体培养基中，在37 °C振荡培养，直至OD600达到1.0。通常需要培养5–6小时，使菌液达到目标光密度。
- 立即将菌液置于冰上，后续所有操作均在冰上进行，并使用预冷至4 °C的离心机。
- 在4 °C、2,000 × g条件下离心10分钟，收集菌体。
- 倾去上清液，将菌体沉淀重悬于25 mL冰预冷的273 mM蔗糖溶液（pH 7.4，用KOH缓冲）中。
- 再次于4 °C、2,000 × g离心10分钟，重复此洗涤步骤两次。
- 将洗涤后的菌体沉淀重悬于400 µL冰预冷的273 mM蔗糖溶液中，随后加入甘油至终浓度为15%（体积比）。此时菌体可用于电转化，也可分装为70 µL每份，于-80 °C冻存以备后续使用。 ....
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结果
诱导分化并生成群集迁移菌落
图1展示了产生副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）群游菌落的关键步骤示意图（图1A-C）。将游动型菌液点样于群游琼脂平板上，并在24 oC下培养，诱导细菌在固体琼脂表面发生群游细胞分化并增殖。一个典型的群游菌落的体视显微镜图像见图2。体视显微镜图像清晰显示，群游菌落边缘向外延伸出群游焰状结构（swarm-flares）。高倍镜下可见，在群游焰状结构中，细胞仅排列成单层或双层结构，而在菌落中心区域，细胞则堆叠成多层结构（图2A）。群游焰状结构可按照步骤3.8–3.11所述方法（见图1）轻松转移至显微镜载玻片上。重要的是，焰状结构仅包含完全分化的群游细胞群体（图2B），这与菌落.......
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讨论
本文报道了一种用于显微成像的方法 副溶血性弧菌 游动细胞，随后进行下游分析，旨在解析和量化所研究的荧光标记蛋白的亚细胞定位及其他特征。尽管目前已有一些用于显微图像处理与分析的工具14,15,16,17,18，对 副溶血性弧菌 运动细胞的观察仍然具有挑战性，主要是因为它们通常存在于密集的细胞群落中，且细胞长度存在较大差异图2）。因此，自动细胞检测有时会出现错误，导致结果可靠性较低。本方案概述了一种用于培养、成像和分析成群运动细菌细胞的流程 副溶血性弧菌，该方案针对这些细胞的特定需求进行了优化，例如在表面提供可控的生长环境，并进行后续图像分析，以适应紧密生长且长度各异的细胞的存在。
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致谢
本工作由马克斯·普朗克学会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养基组分 | |||
| LB培养基 | Roth | X968.3 | |
| Difco 琼脂，颗粒状 | BD | 214510 | 用于制备含LB培养基的LB琼脂 |
| Difco 心脑浸出液琼脂（Heart Infusion Agar） | BD | 244400 | 用于制备HI琼脂群游平板 |
| Agarose NEEO，超纯级 | Roth | 2267.3 | 用于制备显微镜观察用琼脂糖垫 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 添加剂 | |||
| L-阿拉伯糖 | Roth | 5118.3 | 用于诱导pBAD衍生物 |
| 2,2'-联吡啶 | Sigma Aldrich | D216305-25G | 用于制备HI琼脂群游平板 |
| 二水合氯化钙 | Roth | 5239.1 | 用于制备HI琼脂群游平板 |
| 氨苄青霉素钠盐 | Roth | K029.3 | |
| 氯霉素 | Roth | 3886.3 | |
| PBS缓冲液 | - | - | 磷酸盐缓冲盐水的标准配方 |
| D(+)蔗糖 | Roth | 4621.1 | 用于制备电转感受态细胞 |
| 甘油 | Roth | 3783.5 | 用于制备电转感受态细胞 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 硬件 | |||
| 带凸缘的150 mm × 20 mm培养皿 | Sarstedt | 82.1184.500 | 用于制备HI琼脂群游平板 |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | - | 用于干燥HI琼脂群游平板 |
| Gene Pulser Xcell 微生物系统 | BioRad | 1652662 | 用于质粒DNA的电穿孔 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 软件 | |||
| MetaMorph Offline（版本 7.7.5.0） | Molecular Devices | - | 用于显微镜图像分析 |
| Excel | Microsoft | - | 用于显微镜数据分析 |
参考文献
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The ....
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重印与许可
