세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도<em&gt; 비브리오 균 (Vibrio parahaemolyticus)</em&gt; Swimmer and Swarmer Cells

요약

이 프로토콜은 차별적으로 구별되는 Vibrio parahaemolyticus 헤모글로빈 과 swarmer 세포의 단일 세포 현미경 검사를 가능하게합니다. 이 방법은 단일 세포 분석을 위해 쉽게 얻을 수있는 덩어리 세포 집단을 생산하고 세포 배양의 준비, 스웜머 분화의 유도, 샘플 준비 및 이미지 분석을 다루고있다.

초록

단백질의 세포 내 지방화를 연구하는 능력은 많은 세포 과정을 이해하는 데 필수적입니다. 이것은 세균 공동체 내에 존재하는 세포를 영상화 할 때 특히 어려울 수있는 형광 현미경 검사를 위해 단일 세포를 얻을 수있는 능력을 필요로합니다. 예를 들어, 인간 병원체 Vibrio parahaemolyticus 는 액상 조건에서 짧은 막대 모양의 수영 세포로 존재하며, 표면 접촉시 고체 표면에서의 성장을 위해 특수화 된 고도로 연장 된 스웜머 세포의 하위 모집단으로 분화한다. 이 논문은 V. parahaemolyticus 의 두 가지 미분 상태에서 단일 세포 형광 현미경 분석을 수행하는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 V.parahaemolyticus의 분열 세포주기를 매우 재현 가능하게 유도하여 고체 표면에 대한 증식을 촉진합니다. 상기 방법은 t로부터 연장되는 분화 된 스머머 셀의 플레어를 생성한다그는 군집 식민지의 가장자리에있다. 특히, 떼죽음의 끝에는 세포의 단일 층에 스머머 세포가 존재하기 때문에 현미경 슬라이드 및 단일 세포의 후속 형광 현미경 이미징으로 쉽게 전송할 수 있습니다. 또한, 박테리아 사회의 인구 통계 학적 표현을위한 이미지 분석의 워크 플로우가 제시됩니다. 원리의 증거로서, V.parahaemolyticus의 수영 세포 및 스머머 세포에서의 화학 주성 신호 전달 배열의 세포 내 국소화 분석 이 기재되어있다.

서론

박테리아는 끊임없이 외부 환경에 변화를 경험하고 이에 따라 행동을 변경하고 적응시키는 여러 기술을 개발했습니다. 그러한 메커니즘 중 하나는 변경된 환경을보다 잘 보완하는 별개의 세포 유형으로의 분화를 포함한다. 분화에는 종종 세포주기의 조절, 세포 형태학 및 세포의 시공간적 조직화에 주요 변화가 따른다. 분화를 겪을 수있는 한 가지 유기체는 부비강염 ( Vibrio parahaemolyticus) 입니다. V. parahaemolyticus 는 Vibrionaceae 에 속하며, 이는 일반적으로 신선한 물이나 소금물에 서식하는 proteobacteria 계열입니다. Vibrionaceae 는 환경 에 널리 분포하며 Vibrio cholerae.V를 포함하여 사람에서 장관 감염을 일으키는 몇 종을 포함 합니다. parahaemolyticus 는 이형 체 (dimorphic organism)이며, 그 변이 형 생물체에 대한 변화를 수용하기위한 반응으로서 2 가지 별개의 세포 유형으로 분화 할 수있다외부 환경. 수성 환경에서, 그것은 오래 막대 기둥에 위치한 단 극성 편모가있는 짧은 막대 모양의 수영 세포로 존재합니다. 표면 접촉시, 스머머 셀로의 분화가 유발된다. Swarmer 세포 분화는 두 가지....

프로토콜

1. Electro-competent V. parahaemolyticus 세포의 준비 및 형질 전환 체 세포의 전기 영동

참고 : 프로토콜의 다음 섹션에서는 electro-competent 세포의 준비 및 수영 세포에 플라스미드 DNA의 electroporation을 수행 할 수 있습니다. 이 단계는 형광 단백질이 플라스미드로부터 정상적으로 발현되는 경우 중요합니다.

1. 37 ° C에서 밤새 100 μg / ML 암피실린과 부화가 포함 된 신선한 LB 한천 플레이트에 -80 ° C 글리세롤 주식에서 V.의 parahaemolyticus 세포를 스트레칭.
2. 다음날, V. parahaemolyticus 의 단일 식민지로 LB 배지 200 ML을 접종하고 OD ₆₀₀ 이 1.0에 도달 할 때까지 흔들어주는 조건하에 37 ° C에서 배양합니다. 보통 세포 배양이 원하는 광학 밀도에 도달하기 위해 5 ~ 6 시간의 배양이 필요합니다.
3. 즉시 얼음과 퍼프로 세포를 옮긴다.얼음과 4 ℃ 사전 냉각 원심 분리기에서 모든 추가 단계를 수행하십시오.
4. 4 ℃에서 10 분간 2,000 x g에서 세포 수확.

결과

맹목적인 식민지의 분화 및 생성 유도

그림 1 은 V. parahaemolyticus ( 그림 1A-C )의 군집 콜로니 생산에 관련된 중요한 단계의 스키마를 제공합니다. Swarmmer 한천 배지를 24 ℃에서 배양하여 고형 한천 표면에서 스머머 분화 및 증식을 유도 하였다. 떼 지어 서식하는 콜로니의 대표적인 입체 현미경 이미지가 그림 2 에 나와 있습니다. 스테레오 현미경 이미징은 떼 지어 식민지 주변에서 뻗은 떼어 내기를 명확하게 보여줍니다. 더 높은 배율은 떼 지어 번쩍이는 곳에서 세포가 단층 또는 이중층으로 만 분류되는 반면 군집 - 식민지의 중간에서는 세포가 여러 층으로 쌓여 있음을 보여줍니다 ( 그림 .......

토론

이 논문은 V. parahaemolyticus swarmer 세포의 현미경 검사법에 대한 방법을보고하고, subcellular localization과 연구 된 형광 표지 단백질의 다른 특징을 분석하고 정량화하기위한 하향 분석을 수행 하였다. 현미경 검사 이미지 처리 및 분석을위한 몇 가지 도구가 있지만 ^{14 , 15 , 16 , 17 , 18} 의 V. parahaemolyticus swarming 세포의 분석은 주로 밀도가 높은 세포 집단 내에 존재하고 세포 길이의 높은 변화 그림 2 ). 따라서 자동 셀 감지가 잘못되어 결과가 다소 신뢰할 수 없습니다. 이 프로토콜은

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Media 구성 요소
LB medium	Roth	X968.3
Difco Agar, granulated	BD	214510	LB 매체
Difco Heart Infusion Agar BD		244400	HI 한천 군집 플레이트 Agarose NEEO의 준비
, 초고품질	Roth	2267.3	현미경 아가로스 패드 제조용
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Additives
L-arabinose	Roth	5118.3	pBAD 유도
2,2'-Bipyridyl	유도에 사용Sigma Aldrich	D216305-25G	HI 한천 군집 플레이트 준비
용 염화칼슘 이수화물	Roth	5239.1	HI 한천 군집 플레이트 제조
Ampicillin sodium salt	Roth	K029.3
Chloramphenicol	Roth	3886.3
PBS 완충액	-		인산염 완충 식염
D (+) 설탕	Roth	4621.1	전기 역량 세포 준비
용 글리세롤	로스	3783.5	전기 역량 세포 준비 용
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
>Hardware
페트리 접시 150 mm x 20 mm 캠	Sarstedt	82.1184.500	HI 한천 군집 플레이트
제조 kelvitron t (B 6420)	Heraeus-HI		한천 군집 플레이트 건조에 사용
유전자 펄서 Xcell 미생물 시스템	BioRad	1652662	플라스미드 DNA의 elctroporation에 사용
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Software
MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)	Molecular	Devices-Use	microscopecopy image analysis
Excel		Microsoft-used	for microscopecopy data analsis

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