Ультразвуковое обследование часто используется в мышах. Дорогой высокого разрешения ультразвуковых устройств были разработаны для этой цели. Этот протокол описывает доступные эхокардиографические процедуры, в сочетании с гистологической морфометрический анализ для определения сердца морфологии.
Все большее количество моделей генетически модифицированных мышь стала в последние годы. Кроме того количество фармакологических исследований, выполненных в мышей является высоким. Фенотипические характеристики этих моделей мыши также требует изучения функции сердца и морфологии. Часто используемые подходы к характеризуют функции сердца и морфология мышей эхокардиография и магнитно-резонансная томография (МРТ). Оборудование ультразвуковое и МРТ специализированных для использования в мелких грызунов является дорогостоящим и требует выделенного пространства. Этот протокол описывает кардиологических измерений в мышей с использованием клинических эхокардиографические системы с 15 МГц человека сосудистого зонда. Измерения проводятся на наркотизированных взрослых мышей. По крайней мере три последовательности изображений регистрируются и анализируются для каждого животного в M-режиме в представлении парастернальной короткой оси. Впоследствии, сердечной гистологическое обследование, и диаметры cardiomyocyte определяются на гематоксилином-эозином или зародышей пшеницы агглютининов (WGA)-окрашенных парафиновых срезах. Плотность судна — определяется morphometrically после Pecam-1 иммуноокрашивания. Протокол был успешно применяется для фармакологических исследований и различных генетических животных моделей в исходных условиях, а также после экспериментальной инфаркт миокарда, постоянным перевязка левой передней нисходящей коронарной артерии ( ЛАД). По нашему опыту, Эхокардиографическое исследование ограничивается наркотизированных животных и осуществимым в взрослых мышей, весом по меньшей мере 25 g.
Большое разнообразие моделей генетически модифицированные мыши доступны, и количество фармакологических исследований на мышах-высокий1,2. Часто используемые подходы для фенотипического описания функции сердца и морфология в этих моделях мыши3эхокардиография и МРТ. Цель представленных протокола заключается в анализе функции сердца и морфология в взрослых мышей. Она сочетает в себе эхокардиографические, гистологические и иммуногистохимическое измерения. Ультразвуковое обследование широко используется в мышей4,5,6,,78,9,10,11, 12. Pachon и др. 11 определены 205 исследований, опубликованных в циркуляции, Исследования циркуляции, Американский журнал физиологии – сердца и кровообращения физиологиии Сердечно-сосудистых исследований между 2012 и 2015 годы использовано ультразвуковое обследование в животных.
Эхокардиографии используется для выявления сердечной фенотипы в генетически измененных мышей5,6,13,14,,1516, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, а также о том, как анализировать функции сердца в хроническая гипертрофия перегрузки индуцированной ишемии миокарда и кардиомиопатия модели мышей (обзор в12). Улучшенная эхокардиография оборудование позволяет для стандартной мерой левого желудочка измерения систолического и диастолического (LV), ткань Doppler изображений, эхография миокарда контраст и оценки региональных функции LV и коронарного резерва 12. в идеале, ультразвуковое обследование должно выполняться в сознательных мышей, чтобы избежать негативные последствия анестезии на сократительной функции, вегетативная рефлекс управления, и ЧСС11. Тем не менее этот подход ограничен требованием для обучения животных; трудности в поддержании температуры тела стабильным; движение артефакты; стресса; очень высокие частоты сердца; и требования по крайней мере двух следователей для выполнения эксперимента, особенно, если большое количество животных находятся под следствием. Интересно, что недавнее исследование сообщил никаких различий в эхокардиографических параметров в подготовленных и неподготовленных животных19. Мы осуществляем эхокардиографические измерений на наркотизированных мышей. Протоколы разных анестезии будет обсуждаться ниже.
Хотя стандартное разрешение эхокардиография (> 10 МГц) является достаточной для измерения LV систолического и диастолического размеры и функции сердца у взрослых мышей, метод ограничен в его описание базовых структурных явлений. Таким образом, мы объединяем в естественных условиях измерений с гистологическим и иммуногистохимического анализа для измерения, например, диаметра и судно плотности cardiomyocyte. Другие гистологического и иммуногистохимического исследования, например определение распространения, экспертиза апоптоза, инфаркте размеры, определение фиброза и конкретных маркер выражения, могут также выполняться на тот же тип Обработка тканей, но не являются предметом настоящего Протокола. Сочетание в vivo Эхокардиографическое обследование с гистологический анализ обеспечивает дополнительное понимание базовых структурных изменений. В качестве дополнительного шага мы можем завершить эти измерения с молекулярной и ультра-структурных исследований. Гистологический анализ не только полное ультразвуковое обследование, но и стать незаменимым при резолюции эхокардиографии не является достаточным. Это особенно верно в моделях генетически измененных мышей, которые являются эмбриональных смертоносных23,24.
Различные методы были разработаны для оценки сердечной структуры и функции в мышей, в том числе эхокардиография, повысить контраст МРТ, микро КТ и ПЭТ-сканирование. Благодаря своей эффективности и простоте эхокардиографии является наиболее широко используемый метод для функционально…
The authors have nothing to disclose.
Работа была поддержана правительством Франции (национального исследовательского агентства, НРУ) через программу «Инвестиции в будущее» LABEX SIGNALIFE (Справочник АНР-11-LABX-0028-01) и грантов на K. D. W. от Ассоциации налить sur la исследований le рака, Фонд-де-Франс и план рака Inserm. Д. б. и а. в. получили стипендии от Fondation pour la Recherche сообщала и из города Ниццы, соответственно. Echocardiograph и датчик были любезно предоставляемый Philips. Мы благодарим A. Borderie, S. Destree, M. Кутаджар-Bossert, A. Landouar, A. Мартр, A. Biancardini и S. м. Вагнер за их квалифицированную техническую помощь.
Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
Imaging Computer | Dell | ||
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
Xylene | Sakura | 8733 | |
Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
slide boxes | Sakura | 3958 | |
eosine solution | Sakura | 8703 | |
hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
staining jars | VWR | MARI4200005 | |
Incubator | Binder | 9010-0012 | |
DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |