Эхокардиографических и гистологической экспертизы сердечной морфологии в мышь
Summary
Ультразвуковое обследование часто используется в мышах. Дорогой высокого разрешения ультразвуковых устройств были разработаны для этой цели. Этот протокол описывает доступные эхокардиографические процедуры, в сочетании с гистологической морфометрический анализ для определения сердца морфологии.
Abstract
Все большее количество моделей генетически модифицированных мышь стала в последние годы. Кроме того количество фармакологических исследований, выполненных в мышей является высоким. Фенотипические характеристики этих моделей мыши также требует изучения функции сердца и морфологии. Часто используемые подходы к характеризуют функции сердца и морфология мышей эхокардиография и магнитно-резонансная томография (МРТ). Оборудование ультразвуковое и МРТ специализированных для использования в мелких грызунов является дорогостоящим и требует выделенного пространства. Этот протокол описывает кардиологических измерений в мышей с использованием клинических эхокардиографические системы с 15 МГц человека сосудистого зонда. Измерения проводятся на наркотизированных взрослых мышей. По крайней мере три последовательности изображений регистрируются и анализируются для каждого животного в M-режиме в представлении парастернальной короткой оси. Впоследствии, сердечной гистологическое обследование, и диаметры cardiomyocyte определяются на гематоксилином-эозином или зародышей пшеницы агглютининов (WGA)-окрашенных парафиновых срезах. Плотность судна — определяется morphometrically после Pecam-1 иммуноокрашивания. Протокол был успешно применяется для фармакологических исследований и различных генетических животных моделей в исходных условиях, а также после экспериментальной инфаркт миокарда, постоянным перевязка левой передней нисходящей коронарной артерии ( ЛАД). По нашему опыту, Эхокардиографическое исследование ограничивается наркотизированных животных и осуществимым в взрослых мышей, весом по меньшей мере 25 g.
Introduction
Большое разнообразие моделей генетически модифицированные мыши доступны, и количество фармакологических исследований на мышах-высокий1,2. Часто используемые подходы для фенотипического описания функции сердца и морфология в этих моделях мыши3эхокардиография и МРТ. Цель представленных протокола заключается в анализе функции сердца и морфология в взрослых мышей. Она сочетает в себе эхокардиографические, гистологические и иммуногистохимическое измерения. Ультразвуковое обследование широко используется в мышей4,5,6,,78,9,10,11, 12. Pachon и др. 11 определены 205 исследований, опубликованных в циркуляции, Исследования циркуляции, Американский журнал физиологии – сердца и кровообращения физиологиии Сердечно-сосудистых исследований между 2012 и 2015 годы использовано ультразвуковое обследование в животных.
Эхокардиографии используется для выявления сердечной фенотипы в генетически измененных мышей5,6,13,14,,1516, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, а также о том, как анализировать функции сердца в хроническая гипертрофия перегрузки индуцированной ишемии миокарда и кардиомиопатия модели мышей (обзор в12). Улучшенная эхокардиография оборудование позволяет для стандартной мерой левого желудочка измерения систолического и диастолического (LV), ткань Doppler изображений, эхография миокарда контраст и оценки региональных функции LV и коронарного резерва 12. в идеале, ультразвуковое обследование должно выполняться в сознательных мышей, чтобы избежать негативные последствия анестезии на сократительной функции, вегетативная рефлекс управления, и ЧСС11. Тем не менее этот подход ограничен требованием для обучения животных; трудности в поддержании температуры тела стабильным; движение артефакты; стресса; очень высокие частоты сердца; и требования по крайней мере двух следователей для выполнения эксперимента, особенно, если большое количество животных находятся под следствием. Интересно, что недавнее исследование сообщил никаких различий в эхокардиографических параметров в подготовленных и неподготовленных животных19. Мы осуществляем эхокардиографические измерений на наркотизированных мышей. Протоколы разных анестезии будет обсуждаться ниже.
Хотя стандартное разрешение эхокардиография (> 10 МГц) является достаточной для измерения LV систолического и диастолического размеры и функции сердца у взрослых мышей, метод ограничен в его описание базовых структурных явлений. Таким образом, мы объединяем в естественных условиях измерений с гистологическим и иммуногистохимического анализа для измерения, например, диаметра и судно плотности cardiomyocyte. Другие гистологического и иммуногистохимического исследования, например определение распространения, экспертиза апоптоза, инфаркте размеры, определение фиброза и конкретных маркер выражения, могут также выполняться на тот же тип Обработка тканей, но не являются предметом настоящего Протокола. Сочетание в vivo Эхокардиографическое обследование с гистологический анализ обеспечивает дополнительное понимание базовых структурных изменений. В качестве дополнительного шага мы можем завершить эти измерения с молекулярной и ультра-структурных исследований. Гистологический анализ не только полное ультразвуковое обследование, но и стать незаменимым при резолюции эхокардиографии не является достаточным. Это особенно верно в моделях генетически измененных мышей, которые являются эмбриональных смертоносных23,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Различные методы были разработаны для оценки сердечной структуры и функции в мышей, в том числе эхокардиография, повысить контраст МРТ, микро КТ и ПЭТ-сканирование. Благодаря своей эффективности и простоте эхокардиографии является наиболее широко используемый метод для функционально…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана правительством Франции (национального исследовательского агентства, НРУ) через программу «Инвестиции в будущее» LABEX SIGNALIFE (Справочник АНР-11-LABX-0028-01) и грантов на K. D. W. от Ассоциации налить sur la исследований le рака, Фонд-де-Франс и план рака Inserm. Д. б. и а. в. получили стипендии от Fondation pour la Recherche сообщала и из города Ниццы, соответственно. Echocardiograph и датчик были любезно предоставляемый Philips. Мы благодарим A. Borderie, S. Destree, M. Кутаджар-Bossert, A. Landouar, A. Мартр, A. Biancardini и S. м. Вагнер за их квалифицированную техническую помощь.
Materials
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
References
- Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
- Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research. Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).
- Phoon, C. K., Turnbull, D. H. Cardiovascular Imaging in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 6 (1), 15-38 (2016).
- Wagner, N., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).
- Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016, 7631085 (2016).
- Ghanbarian, H., et al. Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth. PLoS One. 11 (6), e0156953 (2016).
- Meguro, T., et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).
- de Araújo, C. C., et al. Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling. Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).
- Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7 (7), e41691 (2012).
- Colazzo, F., et al. Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation. PLoS One. 10 (4), e0125541 (2015).
- Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).
- Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Echocardiography in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 71-83 (2011).
- Mor-Avi, V., et al. Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).
- Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice. Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).
- Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice. Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).
- Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).
- Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models. Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).
- Fayssoil, A., Tournoux, F. Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography. Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).
- Schoensiegel, F., et al. High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens. Ultraschall Med. 32, S124-S129 (2011).
- Yariswamy, M., et al. Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction. J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).
- Jara, A., et al. Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice. Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).
- Kerr, B. A., et al. Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium. Nat Commun. 7, 10960 (2016).
- Wagner, N., et al. Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms’ tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms’ tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression. Nat Commun. 5, 5852 (2014).
- Yang, X. P., et al. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice. Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).
- Rottman, J. N., et al. Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice. J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).
- Quiñones, M. A., et al. Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).
- van Laake, L. W., et al. Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction. Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms’ tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).
- Wagner, K. D., et al. RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse. Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).
- Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure. Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).
- Ismail, J. A., et al. Immunohistologic labeling of murine endothelium. Cardiovasc Pathol. 12 (2), 82-90 (2003).
- Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).
- Ayoub, A. E., Salm, A. K. Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus. J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).
- Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).
