Summary
Presentiamo un metodo dettagliato per studiare la fisiologia placentare umana in vivo a termine. Il metodo combina il campionamento di sangue dai vasi in entrata e in uscita sui lati materni e fetali della placenta con misurazioni a ultrasuoni del flusso di sangue del volume e del campionamento dei tessuti placentari.
Abstract
La placenta umana è altamente inaccessibile per la ricerca mentre è ancora in utero . L'attuale comprensione della fisiologia placentare umana in vivo è quindi fondata in gran parte su studi sugli animali, nonostante l'elevata diversità tra le specie in anatomia placentare, emodinamica e durata della gravidanza. La stragrande maggioranza degli studi di placenta umana sono studi di perfusione ex vivo o studi in trofoblasti in vitro . Anche se studi in vitro e modelli animali sono essenziali, l'estrapolazione dei risultati da tali studi alla placenta umana in vivo è incerta. Abbiamo cercato di studiare fisiologia umana della placenta in vivo a termine e presentare un protocollo dettagliato del metodo. Sfruttando l'accesso intraabdominale alla vena uterina poco prima dell'incisione uterina durante la sezione cesarea pianificata, raccogliamo campioni di sangue dalle navi in entrata e in uscita sui lati materni e fetali della placenta. Quando si combinano conMisurazioni di centratura da campioni di sangue con misurazioni del flusso di sangue volume, siamo in grado di quantificare l'assorbimento placentario e fetale e il rilascio di qualsiasi composto. Inoltre, i campioni di tessuto placentare provenienti dalle stesse catene materno-fetali possono fornire misure di densità e attività trasportatori e altri aspetti delle funzioni placentari in vivo . Attraverso questo uso integrativo del metodo di campionamento a 4 navi siamo in grado di testare alcuni dei concetti attuali di trasferimento nutriente e metabolismo placentare in vivo , sia in gravidanze normali che patologiche. Inoltre, questo metodo consente di identificare le sostanze scelte dalla placenta alla circolazione materna, che potrebbero essere un importante contributo alla ricerca di biomarcatori di disfunzione della placenta.
Introduction
Secondo gli Istituti Nazionali di Salute, USA, la placenta è l'organo meno compreso nel corpo umano 1 , 2 , 3 . È difficile accedere e studiare la placenta umana in vivo senza imporre rischi non etici sulla gravidanza in corso. Gli studi sulla funzione placentare nell'uomo sono pertanto largamente basati su modelli in vitro e ex vivo . La maggior parte degli studi in vivo precedenti del trasporto del placenta e del metabolismo sono stati eseguiti negli animali 4 , 5 , 6 . Tuttavia, poiché la struttura e le funzioni placentari variano notevolmente tra le specie, l'estrapolazione dei risultati da animali agli esseri umani deve essere effettuata con cautela. Solo alcuni studi umani più piccoli in vivo hanno studiato l'assorbimento placentare e fetale e il trasporto sotto normali fisiologicheE nessuno ha esplorato il trasferimento integrato di diversi composti 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Questi studi fondamentali dimostrano che studi in vivo della placenta umana sono fattibili e che possono servire a diversi scopi. Innanzitutto, i concetti attuali di funzioni placentari, derivanti principalmente da studi in vitro , ex vivo e animali, possono essere testati in un ambiente umano e quindi forniscono una nuova e più specifica visione della placenta umana. In secondo luogo, le proprietà della placenta disfunzionale associata a crescita fetale aberrante, preeclampsia, diabete materno, sindrome metabolica e altri disturbi metabolici materni possono essere meglio caratterizzati. In terzo luogo, studi umani in vivo forniscono un'opportunità per sviluppare la diagnosiTic e strumenti predittivi di funzione placentare.
Su questo sfondo abbiamo cercato di stabilire una raccolta completa di dati fisiologici per studiare la funzione placentare umana in vivo. Durante una sezione cesarea pianificata, sfruttiamo l'accesso intraabdominale alla vena uterina per raccogliere campioni di sangue dalle navi in entrata e in uscita sui lati materni e fetali della placenta (metodo di campionamento a 4 vasche). Questi campioni vengono utilizzati per calcolare le differenze di concentrazione arteriovenosa accoppiate di sostanze nutritive e altre sostanze 14 . Inoltre misuriamo il flusso di sangue del volume su entrambi i lati della placenta mediante ultrasuoni. Di conseguenza, l'assorbimento placentario e fetale di qualsiasi composto può essere quantificato. Inoltre, è possibile determinare le sostanze rilasciate dalla placenta alle circolazioni materne e fetali 15 , 16 , 17 . Quando si combinanoD con parametri clinici di madre e figlio e analisi di tessuti placentari e di altri tessuti rilevanti, questo metodo ha il potenziale eccitante di integrare molti aspetti delle funzioni placentari in vivo nelle coppie materno-fetali.
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Protocol
Lo studio è stato approvato dai funzionari della protezione dei dati presso l'Ospedale Universitario di Oslo e dal Comitato Regionale per l'Etica della Ricerca Medica e Salute, la Norvegia meridionale 2419/2011. Tutti i partecipanti hanno firmato un consenso informato scritto all'atto dell'inserimento.
1. Preparativi
NOTA: una sequenza temporale per le procedure è descritta in Figura 1 .
Figura 1 : Diagramma di flusso che descrive il timing e il personale coinvolto nella procedura di campionamento a 4 navi.
Un colore rappresenta una persona. La descrizione dettagliata del metodo è riportata nel protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Personale
- Preparare l'attrezzatura, 50 ml di soluzione salina fosfato tamponata 1 M di ghiaccio fredda, 25 mL di soluzione fredda di stabilizzazione RNA e 5 x 0,5 mL di ottima temperatura di taglio (OCT). Etichettare i vacutainers ei tubi. Vedi elenco tentativo di attrezzature.
2. Caratteristiche materne
- Registrare le caratteristiche cliniche e non cliniche materne all'inserimento e ripetere domande e meAsurements, compreso il peso, al momento della consegna. Registrare la durata del periodo di digiuno prima della sezione cesarea e gli episodi ipotensivi che si verificano durante l'intervento chirurgico.
Nota: includere il dataset clinico minimo materno riportato in una recente pubblicazione di Global Pregnancy CoLaboratory (COLAB). Questo articolo contiene anche alcuni aspetti molto importanti nella scelta delle popolazioni dello studio e dovrebbe essere affrontato durante la pianificazione dello studio 18 . - Si consideri la registrazione delle caratteristiche paterne, tra cui l'etnia, l'età e l'indice di massa corporea (BMI).
3. Ultrasuono
- Effettuare l'esame a ultrasuoni Doppler il giorno della consegna, con le donne in stato di digiuno. Eseguire l'esame durante un periodo di ferie, con la donna in posizione semi-supina, inclinata leggermente lateralmente di fronte alla regione di interesse per evitare la compressione dell'arto e della vena cava. Monitorare l'uscita inTensione dagli indicatori meccanici e termici sul display.
- Vena ombelicale
- Visualizzare la vena ombelicale in una transazione sagittale o obliqua dell'addome fetale. Misurare il diametro interno del vaso nella parte dritta della vena ombelicale intra-addominale, prima di ogni ramo visibile. Utilizzare la modalità B regolare e visualizzare il vaso in un angolo di insonazione perpendicolare per le misurazioni di diametro e mantenere diversi fotogrammi ottimali per le misurazioni successive per ridurre al minimo l'effetto dei cambi di diametro pulsatile.
- Ripetere le misurazioni da cinque a dieci volte 19 .
- Nello stesso sito, utilizzare l'ultrasuono Doppler e regolare la sonda per ottenere un angolo di insonanatura il più basso possibile (sempre <30 °) per misurare la velocità massima misurata in base al tempo (TAMX). Ottenere la velocità durante un periodo di 3-5 s (non pulsato).
- Visualizzare la vena ombelicale in una transazione sagittale o obliqua dell'addome fetale. Misurare il diametro interno del vaso nella parte dritta della vena ombelicale intra-addominale, prima di ogni ramo visibile. Utilizzare la modalità B regolare e visualizzare il vaso in un angolo di insonazione perpendicolare per le misurazioni di diametro e mantenere diversi fotogrammi ottimali per le misurazioni successive per ridurre al minimo l'effetto dei cambi di diametro pulsatile.
- Arteria uterina
- Utilizza DopplerUltrasuoni per visualizzare l'arteria uterina mentre attraversa l'arteria iliaca esterna, subito dopo che si racchiude dall'arteria iliaca interna. Regolare la sonda in questo sito per ottenere un basso angolo di insonazione (sempre <30 °) e misurare TAMX. Ottenere la velocità come la velocità media di tre cicli del cuore.
- Poiché è improbabile che si ottiene un angolo perpendicolare allo stesso sito del misuratore di TAMX, seguire la vasca in modo distale per ottenere un angolo corretto per le misurazioni del diametro come vicino ai siti di misurazione del diametro possibile. Escludere le misure di diametro se le navi visibili si sporgono prima di questo sito come valutate con l'ultrasuono a colori Doppler.
- Utilizzare la modalità B regolare e visualizzare il vaso in un angolo di insonazione perpendicolare per le misurazioni di diametro e mantenere diversi fotogrammi ottimali per le misurazioni successive per ridurre al minimo l'effetto dei cambi di diametro pulsatile.
- Ripetere le misurazioni da cinque a dieci volte 19 .
- Notare la posizione della placenta.
4. Campionamento del sangue da 4 vasetti
NOTA: La sequenza temporale delle procedure è descritta in figura 1 e una panoramica dei campioni è illustrata in Figura 2 .
Figura 2 : Schema illustrato della Vasculatura Placentare e dei siti di campionamento.
Nel metodo di campionamento a 4 vasi sono prelevati campioni di sangue dalla vena uterina, dall'arteria radiale (come proxy dell'arteria uterina) e dalle arterie o dalla vena ombelicale. Il flusso sanguigno nell'arteria uterina e la vena ombelicale viene misurato mediante ultrasuoni. Si raccolgono campioni di tessuto dalla placenta. Illustrazione: Øystein H. Horgmo, Università di Oslo.5847fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Procedure di sicurezza
- Fornire tutto il personale della sala operatoria con guanti, abiti chirurgici, maschere e cappotti.
- Fornire i chirurghi e il personale di ricerca in contatto con il campo operativo con abiti chirurgici, maschere, cappelli, abiti e doppi guanti. Gli occhiali sono facoltativi.
- Fornire il personale che gestisce i campioni di sangue con guanti.
- Fornire il personale che gestisce i campioni di placenta con guanti e maschera chirurgica. L'omogeneizzazione richiede l'uso di cappucci.
- Preparazione nel teatro operativo
- Dare un briefing e consegnare l'attrezzatura a tutto il personale che aiuterà il campionamento prima dell'inizio della chirurgia.
- Rivolgersi all'inestetista anestesistico e anestesico che aiuterà con l'accesso arterioso e venoso periferico e accertarsi cheNessun liquido viene somministrato per via endovenosa prima del campionamento.
- Dare alla persona che assiste con l'arteria radiale tre siringhe (10 mL) senza aghi alla persona assistita con il campione della vena antecubita e due siringhe (una 20 mL e una 10 mL) e una siringa per gas a base di sangue (con eparina).
- Preparare due siringhe sterili (20 mL), cinque siringhe sterili (10 mL), tre "aghi a farfalla" e due siringhe di gas sanguigno per il campo di funzionamento.
- Accesso ai vasi sanguigni.
- Seguire la procedura standard prima della sezione cesarea per assicurare l'accesso intravenoso periferico (iv).
NOTA: la vena antecubita è preferibile perché è più facile prelevare campioni da questo sito. - Localizzare l'arteria radiale al polso per ultrasuono o per palpazione. Dopo 0,5 ml di analgesia sottocutanea di lidocaina, inserire una linea arteriosa nell'arteria radiale. Abbandonate il campionamento da questo sito in caso di tre inserimenti non riusciti, oSe la donna sperimenta dolore durante l'inserimento.
NOTA: eseguire la procedura chirurgica della sezione cesarea secondo la procedura standard. Solo le correzioni necessarie per la procedura di campionamento sono sottolineate di seguito.
- Seguire la procedura standard prima della sezione cesarea per assicurare l'accesso intravenoso periferico (iv).
- Campioni di sangue materno
NOTA: Ottenere tutti e tre i campioni di sangue materna (vena uterina, arteria radiale e vena antecubita) simultaneamente prima dell'incisione uterina.- Per la vena uterina, dopo aver aperto la cavità addominale, utilizzare un retrattore per sollevare la parete addominale ed esporre i rami principali delle vene uterine sui lati anterolaterali dell'utero. Ottenere il sangue da rami della vena uterina allo stesso lato della placenta, se possibile, o utilizzare il plesso vena più importante se la placenta si trova nella midline uterina.
- Inserire un ago a farfalla in una siringa del gas di sangue nella vena uterina ad un angolo di circa 30 gradi e raccogliere il sangue attraverso un'aspirazione dolce per evitareemolisi. Tenendo accuratamente la posizione IV dell'ago della farfalla, sostituire la siringa del sangue riempito con una siringa da 20 ml e una siringa da 10 ml consecutivamente.
NOTA: L'accesso ottimale è garantito al meglio quando si trova sul lato contralaterale della vena uterina scelta.
- Inserire un ago a farfalla in una siringa del gas di sangue nella vena uterina ad un angolo di circa 30 gradi e raccogliere il sangue attraverso un'aspirazione dolce per evitareemolisi. Tenendo accuratamente la posizione IV dell'ago della farfalla, sostituire la siringa del sangue riempito con una siringa da 20 ml e una siringa da 10 ml consecutivamente.
- Per l'arteria radiale, aspirare dalla linea intra-arteriosa. Scartare le prime 5 mL e poi aspirare 3 mL in siringa per eparina per analisi del sangue, seguita da 3 mL in due siringhe (20 + 10 mL).
- Per la vena antecubita aspirare delicatamente dal catetere per via endovenosa. Scartare le prime 5 mL e aspirare 30 mL in tre siringhe (10 mL).
- Eseguire un'ispezione finale del sito di campionamento sulla vena uterina prima di iniziare a chiudere l'addome.
- Per la vena uterina, dopo aver aperto la cavità addominale, utilizzare un retrattore per sollevare la parete addominale ed esporre i rami principali delle vene uterine sui lati anterolaterali dell'utero. Ottenere il sangue da rami della vena uterina allo stesso lato della placenta, se possibile, o utilizzare il plesso vena più importante se la placenta si trova nella midline uterina.
- Campioni di sangue fetale
- Quando il bambino è nato, aspirare immediatamente sangue dall'arteria ombelicale senza bloccare il cordone ombelicale o trasportare la placenta. Inizia con spiritoH la siringa per l'analisi del sangue e seguire con tre siringhe da 10 mL, se possibile.
- Quando i campioni arteriosi sono fissati, bloccare il cavo e consegnare il bambino alla ostetrica prima di prelevare il campione dalla vena ombelicale (sangue e 20 + 10 ml di siringhe).
NOTA: ottenere tutti i campioni ombelicali entro pochi secondi dalla consegna e con la placenta in situ a meno che non si sia staccato spontaneamente. - Seguire le raccomandazioni norvegesi sul bloccaggio del cavo tardivo. In caso di bambino afflitto, bloccare e tagliare immediatamente il cavo e la mano al bambino alla ostetrica e al neonatologo.
- Gestione dei campioni di sangue
- Mettere le siringhe del gas sangue sul ghiaccio mentre prepara il resto dei campioni di sangue e li analizza in un analizzatore di gas sangue entro 5 minuti.
- Trasferire immediatamente i campioni di sangue ai vacutainers e posizionare i tubi del plasma su un bilanciere per 1 - 2 minuti prima di metterli in ghiaccio. Lasciare i tubi di siero sul lavoroPanchina per stabilirsi per 30 minuti.
NOTA: questo è un passo fondamentale nella procedura che richiede un'attenzione particolare perché i campioni di tutti e cinque i siti devono essere preparati contemporaneamente per garantire una buona qualità. - Centrifugare i campioni di plasma al più presto e entro 30 minuti a 6 ° C, 2.500 xg per 20 minuti.
- Dopo 30 minuti, centrifugare i campioni di siero a temperatura ambiente per 10 minuti a 2.500 x g.
- Aliquota con attenzione i supernatanti fino a 2 ml di criolette, lasciando 0,5 ml del supernatante sopra il pellet per assicurare il plasma libero da piastrine.
- Conservare i campioni a -80 ° C.
5. Raccolta di tessuto placentare
- Posizionare la placenta piatta su un vassoio di dissezione refrigerato con ghiaccio appena possibile dopo la consegna. Fotografare e misurare il diametro più lungo e il diametro a 90 gradi.
- Pesare la placenta.
- Registrare il peso, i due diametri, qualsiasi gLa patologia del ross, il numero di navi nel cavo e l'intervallo di tempo dalla consegna a quando la placenta è stata posta sul ghiaccio.
NOTA: inviare la placenta all'esame patologico se clinicamente indicato. - Posizionare la placenta con la superficie materna rivolta verso l'alto e identificare 4 - 5 campioni di campionamento situati casualmente in ogni quadrante della placenta, evitando aree di sincera patologia. Rimuovere la decidua usando forbici per tagliare 3 - 5 mm dalla superficie materna. Raccogliere da ogni sito un tessuto di fibre da 1 - 2 cm 3 .
- Lavare leggermente il tessuto raccolto in 50 ml di freddo 1 M PBS. Divide in più pezzi da ogni sito di campionamento e aliquota.
Nota: La dimensione dei pezzi della placenta dipenderà dalle analisi previste. - Aggiungere aliquote di campioni di tessuto da 0,1 a 0,5 cm 3 a 5 tubi di crio e congelare in azoto liquido.
- Aggiungere piccoli pezzi di 0,1 - 0,2 cm 3 al tubo con 25 ml di soluzione di stabilizzazione dell'RNA. Conservare a 46, C per 24 h, scartare la soluzione di stabilizzazione dell'RNA e sostituirla. Congelare.
- Aggiungere pezzi di 0,5 cm 3 ai 5 crioletti con 0,5 ml di OCT, completare con OCT, mescolare e congelare.
- Conservare i campioni a -80 ° C fino all'analisi.
NOTA: Burton et al. Fornisce un'ottima panoramica sugli aspetti pratici del campionamento placentare a seconda delle analisi previste. 20 Si consideri per preparare il tessuto rimanente per l'isolamento delle membrane basali e microvilli, e di raccogliere tessuti deciduali dalla tecnica aspirazione sottovuoto. 21 , 22
6. Caratteristiche neonatali
- Registrare le caratteristiche neonatali, tra cui il punteggio Apgar (1, 5 e 10 min), il sesso, il peso, la lunghezza, l'età gestazionale e l'ammissione alla unità di assistenza intensiva di Newborn (lunghezza e esito del soggiorno).
- Si consideri la misurazione della composizione corporea neonatale mediante misurazioni antropometriche, dispersione dell'ariaPletisismografo o dual x-ray absorptiometry. 23 , 24
7. Calcoli
- Assumere una simile composizione del sangue nell'arteria radiale e uterina e calcolare la differenza di concentrazione arteriovenosa uteroplacenziale.
Differenza di concentrazione arterovenosa intrateraplascenziale = C A - C V
Differenza di concentrazione arteriosa venosa - Umbilicali = C v - C a
Dove C è concentrazione con gli indici: A, l'arteria radiale; V, la vena uterina; V la vena ombelicale e una, l'arteria ombelicale. - Calcolare il flusso di sangue del volume, ml / min (Q):
Dove D è il diametro del vaso (cm), TAMX è la velocità massima misurata in tempo e h è il coefficiente per il profilo di velocità del sangue spaziale. Utilizzare 0,5 come il coefficiente per la vena ombelicale e0,6 per l'arteria uterina 25 , 26 . - Calcola l'assorbimento e rilascio placentare secondo il principio di Fick:
Assorbimento endoplasmatico = ( C A - C V ) x Qm
Assorbimento fetale = ( C v - C a ) X Q f
Indici: m, materna e f, fetale.
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Representative Results
Il metodo di campionamento a 4 navi è applicabile nella pratica clinica e abbiamo ottenuto con successo campioni di sangue da 209 madri / coppie infantili. In 128 di questi abbiamo anche raggiunto per misurare il volume del flusso di sangue. Sono stati ottenuti campioni completi di campionamento a 4 vasi e misure di flusso di buona qualità sia di vasi materni che fetali in 70 coppie madre-feto ( Figura 3 ). Inoltre abbiamo finora raccolto campioni di sangue e placenta da 30 pazienti preeclampici. Abbiamo precedentemente pubblicato articoli sul trasferimento placentare umano di sostanze nutritive, nonché rilascio placentare di fattori vasoattivi, dimostrando due applicazioni del metodo 14 , 15 , 16 .
Esempio di come il metodo a 4 vaso viene utilizzato per studiare il trasferimento placentare
Ci sono arteri significativiDifferenti differenze di glucosio su entrambi i lati della placenta che dimostrano un assorbimento uteroplacenziale e fetale in vivo di glucosio ( Tabella 1 ). Il trasferimento placentare del glucosio dipende dal gradiente glucosio materno-fetale, e quindi sui livelli materno di glucosio. Tuttavia, abbiamo dimostrato in precedenza che questo gradiente, e quindi il trasferimento di glucosio, è influenzato in modo significativo anche dai livelli di insulina fetale e dal consumo di glucosio. Questo è un esempio di come questo metodo illustra un'importante interazione materno-fetale 14 .
| Nave | Glucosio mmol / L | p-value * |
| Arteria radiale | 4,49 [4,22, 4,84] | |
| Vena uterina | 4.23 [3.94, 4.53] | |
| Vena ombelicale | 3.78 [3.52, 4.06] | |
| Arteria ombelicale | 3,24 [2,95, 3,56] | |
| Differenze accoppiate | ||
| Arteria radiale - vena uterina | 0,29 [0,13, 0,41] | <0.001 |
| Arteria ombelicale - vena ombelicale | 0,54 [0,29, 0,76] | <0.001 |
| Arteria radiale - arteria ombelicale | 1,25 [1,03, 1,51] | <0.001 |
Tabella 1: Concentrazioni mediane [Q1, Q3] e differenze arteriovenose del glucosio
* Test Wilcoxon firmato-Rank
Si ritiene che l'assorbimento di glucosio fetale da (rilascio placentare) alla circolazione ombelicale dipenda non solo da oN il gradiente materno-fetale, ma sul flusso sanguigno placentare 5 . Allo stesso modo, può essere rilevante studiare l'assorbimento di glucosio fetale in funzione del peso della placenta o del peso alla nascita. In n = 128 abbiamo trovato un flusso venoso totale ombelicale (Q1, Q3) medio di 196,2 [158,3, 232,2] ml / min e calcolato un mediano di glucosio fetale [Q1, Q3] da (rilascio placentare) alla circolazione ombelicale 0,10 [0,05, 0,15] mmol / min. Normalizzato per il peso di nascita è 0,03 [0,02, 0,04] (mmol / min) / kg. La placenta rilascia 0.16 [0.10, 0.26] (mmol / min) per kg di placenta.
Esempio di come il metodo dei 4 vasi è usato per studiare l'assorbimento placentare
Studi sugli animali suggeriscono che l'acido glutammico è importante sia nell'interconversione degli amminoacidi nella placenta e nel fegato fetale, sia come combustibile ossidativo in altri percorsi metabolici 27 . Utilizzando il metodo di campionamento da 4 piani in placenta abbiamo studiato l'uLe differenze arterovenose teroplacentuali e ombelicale dell'acido glutammico nell'uomo ( Tabella 2 ). Abbiamo trovato un assorbimento placentare (quindi un rilascio fetale) dell'acido glutammico dalla circolazione ombelicale. Inoltre abbiamo trovato un apporto placentare di acido glutammico dalla circolazione materna. Questo assorbimento placentare da entrambe le circolazioni è un esempio di come il metodo dei 4 vasetti può essere utilizzato per dimostrare in vivo nell'uomo che il metabolismo placentare delle sostanze nutritive fa parte della regolazione del trasferimento transplacente.
| Nave | Acido glutammico μmol / L | p-value * |
| Arteria radiale | 61,5 [51,0, 77,7] | |
| Vena uterina | 51,0 [36,3, 65,0] | |
| Vena ombelicale | 39,3 [24,7, 52,8] | |
| Arteria ombelicale | 44,7 [33,1, 59,3] | |
| Differenze accoppiate | ||
| Vena radiale-uterina radiale | 10,4 [1,6, 21,2] | <0.001 |
| Arteria ombelicale-vena vescica | -8,7 [-16,0, 0,2] | <0.001 |
Tabella 2: Concentrazioni mediane [Q1, Q3] e differenze arteriovenose dell'acido glutammico
* Test Wilcoxon firmato-Rank
Esempio di come il metodo dei 4 vasi è utilizzato per studiare la liberazione del placenta
È accertato che la placenta secerne il progesterone e per convalidare il nostro metodo a 4 vasetti sul lato materno della placenta, abbiamo misurato il rilascio in vivo del progesterone a teRm 28 . Abbiamo trovato un significativo rilascio placentare di progesterone alla circolazione materna ( Tabella 3 ). La differenza arteriovenosa osservata dimostra come il metodo di campionamento placentare a 4 vasi possa essere utilizzato per rilevare sostanze rilasciate dalla placenta ed è estremamente importante per studiare gravidanze patologiche.
| Nave | Progesterone nmol / L | p-value * |
| Arteria radiale | 678 [514, 971] | |
| Vena uterina | 1852 [1059, 2786] | |
| Differenze accoppiate | ||
| Vena radiale-uterina radiale | -1187 [-1855, -404] | p <0.001 |
Tabella 3: Concentrazioni mediane [Q1, Q3] e differenza arterovenosa uteroplacenziale di progesterone
* Test Wilcoxon firmato-Rank
Figura 3 : diagrammi di flusso e illustrazione dei partecipanti inclusi e persi.
A. mostra l'inclusione dei partecipanti, dimostrando che i partecipanti sono stati persi principalmente a causa dell'inizio del lavoro prima della sezione cesarea o della mancanza di personale sufficiente a condurre lo studio. B. Delle 179 donne con gravidanze normali (blu) sono stati ottenuti campioni di sangue da 4 vasetti in 162 (91%) (campioni di sangue fetali incompleti: campioni di sangue neri e incompleti, grigi). Cinquantadue (28%) partecipanti non sono stati inclusi per le misurazioni a ultrasuoni a causa di limitazioni logistiche. Del 128 partecipanti (72%) sottoposti a ultrasuoni, sono stati ottenuti misurazioni del flusso sanguigno al lato fetale della placenta in tutti i partecipanti (verde chiaro), mentre le misure complete del flusso sanguigno sia a livello materno che fetale sono state ottenute in 77 (60%) (verde scuro). Illustrazione: Øystein H. Horgmo, Università di Oslo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo di campionamento delle 4 navi in placenta è rilevante per tre scopi principali. In primo luogo, può essere usato per studiare come le sostanze specifiche vengono prelevate dalla placenta sul lato materno e eventualmente trasferite alla circolazione ombelicale e al feto, come dimostrato dai nostri studi sul glucosio e sugli amminoacidi. In secondo luogo, il metodo è molto rilevante per studiare sostanze prodotte dalla placenta e rilasciate alle circolazioni materne o fetali, come dimostrato dai risultati del progesterone. In terzo luogo, può essere utile studiare come il feto in vivo elimina i prodotti di scarto durante la rapida crescita e il rimodellamento dei tessuti.
Fasi critiche e problemi logistici del metodo dei 4 vasetti
Il campionamento di 4 campioni di placenta è stato precedentemente utilizzato per determinare il trasferimento placentare di macronutrienti in vivo in gravidanze fisiologiche normali 8 , 10 ,Ss = "xref"> 12, ma con un numero limitato di soggetti di studio. L'uso limitato del campionamento a 4 navi è probabilmente dovuto alla logistica esigente della procedura. Un buon coordinamento tra il paziente, i ricercatori e il personale dei dipartimenti della medicina fetale, dell'ostetica e dell'anestesiologia è essenziale per impiegare questo metodo. Crediamo che sia stato un grande vantaggio che alcuni degli investigatori principali sono ostetrici, conoscendo le procedure cliniche e il personale chiave. Quindi le procedure di studio sono state implementate accanto alla pratica clinica quotidiana. Coordinando e assicurando ogni fase della procedura, abbiamo ottenuto campioni da oltre 200 coppie madre / neonato. Inoltre, la nostra strategia è stata mantenere la procedura di campionamento in poche mani perché ci sono sfide tecniche nella procedura che sono decisive per il successo del campionamento e troppi campionatori possono introdurre fonti inutili di variazione dei dati. ConsequSi raccomanda pertanto che tutti gli esami sonografici debbano essere eseguiti dallo stesso esaminatore utilizzando la stessa macchina ad ultrasuoni. L'attrezzatura deve essere scelto con cura, in quanto la risoluzione della parete del recipiente è cruciale. Le arterie uterine nel terzo trimestre sono particolarmente difficili da misurare perché la dimensione uterina e il contenuto rendono difficile ottenere sia l'angolo di insonazione perpendicolare utilizzato per le misure di diametro e l'angolo di insonazione basso per le misurazioni della velocità di flusso nello stesso sito stesso. Inoltre, il campionamento di sangue efficace richiede l'identificazione di un luogo appropriato di campionamento della vena uterina e una dolce aspirazione. Sul lato ombelicale la fragilità degli eritrociti fetali richiede particolare attenzione alla forza di aspirazione. È la nostra esperienza che la ritardata consegna o minore stress al neonato è stata associata con una primitiva contrazione dell'arteria ombelicale, con conseguente riduzione del volume del campione arterioso.
Problemi metodologici / analitici del metodo dei 4 vasetti
È importante affrontare diverse questioni metodologiche nell'interpretazione dei risultati di uno studio di placenta da 4 vasetti. In primo luogo, se si vuole calcolare la massa di una sostanza presa in consegna o rilasciata dalla placenta, è importante considerare il volume del passaggio del sangue. Va tenuto presente che la vena uterina non solo scola la placenta, ma anche lo scarico del muscolo uterino, e che la vasculatura uterina in vari gradi anastomosi con la vasculatura ovarica e vaginale. Successivamente, è importante considerare che lo scambio di acqua attraverso la placenta può influenzare il concentratoLe razioni misurate e quindi influenzano le differenze di concentrazione arteriovenose calcolate. Idealmente, questo è meglio affrontare regolando le differenze di concentrazione per l'acqua persa o guadagnata in ciascuna coppia madre-feto. Ciò può essere ottenuto misurando una sostanza che non viene presa o liberata dalla placenta o dall'utero. Le concentrazioni di emoglobina o percentuali calcolate di eritrociti (ematocrito) possono servire da fattori di correzione per lo scambio di acqua. Inoltre, quando si interpreta l'assunzione o il rilascio di composti sul lato materno della placenta può essere di interesse per ottenere differenze arteriovenose in altri tessuti per il confronto. Abbiamo quindi incluso un campione di sangue dalla vena antecubita per caratterizzare caratteristiche specifiche della placenta confrontando le differenze arteriovenose rispetto alla placenta con quelle del letto capillare dell'avambraccio. Abbiamo trovato questo confronto particolarmente interessante quando abbiamo testato il rilascio placentare di sFlt-1 e la crescita placentare faPoiché cellule endoteliali sistemiche potrebbero essere una fonte potenziale di questi composti 14 . A seconda della domanda di ricerca potrebbe essere importante collegare le differenze arteriovenose con il peso della placenta per calcolare l'efficienza placentare, cioè in termini di (mmol / L) / kg o (mmol / min) / kg di placenta.
Limitazioni e punti di forza del metodo dei 4 vasetti
Anche se la fisiologia placentare è meno influenzata dalla sezione cesarea che per lo stress della consegna vaginale, ci sono diverse limitazioni a questo metodo. La consegna vaginale è raccomandata nella maggior parte dei casi di complicanze comuni di gravidanza (come la preeclampsia, il diabete, l'obesità e la moderata macrosomia fetale), che possono limitare e bias l'assunzione. Anche quando ottimizza ogni fase del metodo è difficile ottenere misure e campioni completi in ogni paziente a causa delle difficoltà tecniche nella procedura di campionamento del sangue e di ultrasuoniMisure di flusso ume ( Figura 3 ). Inoltre, sebbene le misure di ultrasuoni siano condotte nel più breve tempo possibile per l'intervento chirurgico, sono intrinsecamente condotte prima dell'anestesia spinale e del campionamento del sangue. Da ciò segue che l'uscita cardiaca materna (CO) può cambiare e possibilmente influenzare il flusso sanguigno uteroplacenziale (e anche feto-placentare). La possibile modifica del CO causata dall'anestesia spinale viene compensata dalla fenilefrina che è stata utilizzata nello studio in corso. I dati preliminari di un sottoinsieme dei nostri partecipanti (n = 23) non mostrano alcuna alterazione significativa del CO prima dell'anestesia spinale e al momento del campionamento (dati non pubblicati). Utilizzando il metodo di campionamento da 4 vasche nell'uomo, rispetto agli animali, limita sia la possibilità di introdurre una variabile temporale che manipolare il contenuto di sangue 5 , 29 , 30 . Da queste considerazioni, ne consegue che i 4 vasetti Il metodo di campionamento è trasversale e largamente osservativo per natura, ei dati ottenuti devono essere analizzati di conseguenza. D'altra parte, il metodo di campionamento a 4 vaso offre una possibilità unica per studiare in vivo la fisiologia e la fisiopatologia placentare umana, con tutti i fattori interagenti in gioco, una situazione che non può mai essere riprodotta in vitro . Offre un'ottima opportunità per testare ipotesi emerse da animali o da altri studi sperimentali. Allo stesso modo, può generare nuove ipotesi che devono essere testate meccanicamente in vitro e in studi sugli animali.
Potenziali applicazioni del metodo dei 4 vasetti
In gravidanze patologiche, le differenze di concentrazione arteriovenosa materna e fetale sono state finora studiate separatamente e consentono di sperimentare alcune delle ipotesi esistenti in vivo 15 , 16 ,Ass = "xref"> 31. Il metodo di campionamento a 4 navi offre l'opportunità apprezzabile di studiare insieme l'unità materna, placentare e fetale, piuttosto che come entità distinte in gravidanze patologiche e possono sparire nuova luce su vecchie e nuove domande nell'ambito dell'interazione materno-fetale. Il metodo di campionamento a 4 navi può essere applicato a una vasta gamma di domande di ricerca in gravidanze normali e patologiche a seconda delle ulteriori analisi dei campioni. La scelta dei vacutainers, il volume del sangue, la gamma di placenta e altri campioni di tessuto dovrebbero essere decisi in base alla domanda di ricerca. Burton et al. Hanno recentemente pubblicato un ottimo documento che descrive le procedure per garantire campioni di buona qualità dei tessuti placentari e consentire la fusione di diverse biobanche per affrontare determinati puzzle che richiedono una grande quantità di campioni da risolvere 20 . I campioni di 4 vasetti possono essere analizzati per studiare il rilascio specifico di esosomi a maternitàLa circolazione, il trasferimento di farmaci, metaboliti e tossine. Le analisi su vasta scala (metabolomiche, proteomiche e lipidomiche) hanno la possibilità di identificare sostanze e metaboliti nel plasma materno che vengono secretati dalla placenta. In tal modo l'istituzione del metodo di campionamento a 4 vasi può identificare i fattori derivanti dalla placenta nella circolazione materna ed eventualmente eliminare i biomarcatori della funzione placentare. Combinata con tecniche di separazione delle materne rivolte a microville e fetali rivolte alle membrane plasmatiche basali del sincicitrofoblasto, il trasferimento di una sostanza può essere studiato insieme all'attività e alla localizzazione delle relative proteine trasportatrici 21 . Inoltre, i meccanismi che regolano il trasferimento di nutrienti in vivo possono essere chiariti analizzando i livelli di nutrienti e micronutrienti nei quattro vasi e relazionano il trasferimento di nutrienti alle misurazioni del sistema di sensibilizzazione nutriente e di energia nella placenta 32 33 . L'infusione di glucosio prima della consegna è un altro approccio possibile. Il trasferimento placentare potrebbe essere correlato a variabili metaboliche materne come i profili lipidici del BMI, del glucosio e del plasma e agli effetti fetali come il peso di nascita e la composizione corporea 18 . Insieme, questi approcci potrebbero illuminare il ruolo integrativo della placenta, essendo collocati al centro dell'interazione tra condizioni e bisogni materna e fetale.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Innanzitutto, ringraziamo sinceramente le madri che hanno partecipato a questo progetto. Successivamente, riconosciamo tutto il personale che ha assistito e facilitato la procedura di campionamento, l'anestesista, l'infermiere anestesista e gli infermieri chirurgici. Il progetto non sarebbe stato possibile senza finanziamenti dall'Autorità regionale per la salute regionale della Norvegia sudorientale e dall'unità consultiva norvegese sulla salute delle donne, dall'Università di Oslo e dai finanziamenti locali forniti dall'Ospedale universitario di Oslo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Maternal body composition | |||
| Impedance scale | Tanita | or similar | |
| Ultrasound measurements | |||
| Sequoia 512 ultrasound machine | Acuson | equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz) | |
| Blood samples | |||
| Arerial cannula | BD Medical | 682245 | or similar |
| 20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-20ES | or similar. 3 needed. |
| 10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle | Termo | SS-10ES | or similar. 9 needed. |
| 5 cc 6% Luer Syringe without Needle | Termo | SS-05S1 | or similar. 2 needed. |
| Arterial blood gas syringe | Radiometer Medical | or similar. 4 needed. | |
| Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge | Greiner Bio-One | 450081 | (intended for single use).3 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL EDTA | Greiner Bio-One | 456043 | or similar. Label with sample site. 10 needed. |
| Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator | Greiner Bio-One | 456305 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator | Greiner Bio-One | 456089 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Vacutainer tube 3 mL 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 454334 | or similar. Label with sample site. 5 needed. |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed. |
| Marked trays to transport the syringes | to transport the blood samples in the operation theatre | ||
| Rocker | for gentle mixing of the samples | ||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Placenta samples | |||
| Metal tray | |||
| Ice | in styrofoam box | ||
| Calibrated scale | |||
| Metal ruler | |||
| 1 M Phosphate buffered saline | Sigma | D1408 | or similar. Dilute 10 M to 1 M before use |
| RNA stabilization solution | Sigma | R0901-500ML | or similar |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | vwr | 361603E | or similar |
| Cryogenic vials, 2.0 mL | Corning | 430488 | or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed. |
| Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL | Greiner Bio-One | 227,285 | or similar. Label with "RNA later", sample site and ID. 2 needed. |
| Liquid nitrogen | in appropriate container | ||
| Fetal body composition | |||
| Calibrated scale | |||
| Measuring tape |
References
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