4-karet prøvetaking til integrative studier av human placental fysiologi<em> In vivo</em

Summary

Vi presenterer en detaljert metode for å studere human placenta fysiologi in vivo på sikt. Metoden kombinerer blodprøvetaking fra innkommende og utgående fartøy på moderens og fostrets sider av moderkagen med ultralydsmålinger av volumblodstrøm og plasentvevssampling.

Abstract

Den menneskelige placenta er svært utilgjengelig for forskning mens den fortsatt er i utero . Den nåværende forståelsen av human placenta fysiologi in vivo er derfor i stor grad basert på dyreforsøk, til tross for det høye mangfoldet blant arter i anestesi, hemodynamikk og graviditetens varighet. De aller fleste human placenta-studier er ex vivo perfusjonsstudier eller in vitro trofoblast-studier. Selv om in vitro- studier og dyremodeller er essensielle, er ekstrapolering av resultatene fra slike studier til human placenta in vivo usikkert. Vi har som mål å studere human placenta fysiologi in vivo på sikt, og presentere en detaljert protokoll av metoden. Utnyttelse av intraabdominal tilgang til livmorvenen rett før livmorskåret under planlagt keisersnitt, samler vi blodprøver fra de innkommende og utgående skinnene på moderens og føtalets sider av moderkaken. Når du kombinerer conSentreringsmålinger fra blodprøver med volumblodstrømsmålinger, er vi i stand til å kvantifisere placenta og føtale opptak og frigjøring av en hvilken som helst forbindelse. Videre kan plasentalvevsprøver fra de samme morfosterparene gi målinger av transportørens tetthet og aktivitet og andre aspekter av plasentalfunksjonene in vivo . Gjennom denne integrerte bruken av 4-fartøyers prøvetakingsmetode kan vi teste noen av de nåværende konseptene av plasental næringsmiddeloverføring og metabolisme in vivo , både i normale og patologiske graviditeter. Videre muliggjør denne metoden identifisering av substanser utsatt av moderkrekken for moderens sirkulasjon, noe som kan være et viktig bidrag til søket etter biomarkører av moderkreftdysfunksjon.

Introduction

Ifølge National Institutes of Health, USA er placenta det minst forstått organ i menneskekroppen ^{1 , 2 , 3} . Det er vanskelig å få tilgang til og studere den menneskelige placenta in vivo uten å påføre uetiske farer på den pågående graviditeten. Studier av plasentalfunksjon hos mennesker er derfor i stor grad basert på in vitro- og ex vivo- modeller. De fleste tidligere in vivo- studier av plasentransport og metabolisme har blitt utført hos dyr ^{4 , 5 , 6} . Men siden placenta strukturer og funksjoner varierer betydelig mellom arter, må ekstrapolering av resultater fra dyr til mennesker gjøres med forsiktighet. Bare noen få mindre humane in vivo- studier har undersøkt plasental- og føtalopptak og transport under normal fysiologiskAl-betingelser, og ingen har utforsket den integrerte overføring av flere forbindelser ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Disse grunnleggende studiene illustrerer at in vivo studier av human placenta er mulige, og at de kan tjene flere formål. For det første kan nåværende konsepter av plasentalfunksjoner som hovedsakelig er avledet fra in vitro , ex vivo og dyreforsøk, bli testet i en human setting og dermed gi ny og mer spesifikk innsikt i den menneskelige placenta. For det andre kan egenskaper av den dysfunksjonelle placenta forbundet med avvigende fostervekst, preeklampsi, maternær diabetes, metabolsk syndrom og andre materielle metabolske forstyrrelser, bli bedre karakterisert. Tredje menneskelige in vivo- studier gir en mulighet til å utvikle diagnoserTic og prediktive verktøy for plasental funksjon.

På denne bakgrunnen hadde vi som mål å etablere en omfattende samling av fysiologiske data for å undersøke human placentafunksjon in vivo. Under en planlagt keisersnitt utnytter vi den intraabdominale tilgangen til livmorvenen for å samle blodprøver fra de innkommende og utgående fartøyene på moderens og fostrets sider av moderkaken (4-kar-prøvetakingsmetoden). Disse prøvene brukes til å beregne de parrede arteriovenøse konsentrasjonsforskjeller av næringsstoffer og andre stoffer ¹⁴ . I tillegg måler vi volumblodstrøm på begge sider av morkaken ved ultralyd. Følgelig kan plasentalt og føtal opptak av en hvilken som helst forbindelse kvantifiseres. Videre er det mulig å bestemme substanser frigjort av moderkaken til maternelle og føtal sirkulasjoner ^{15 , 16 , 17} . Når kombinereD med kliniske parametre av mor og barn, og analyser av placenta og andre relevante vev, har denne metoden det spennende potensialet for å integrere mange aspekter av plasentalfunksjoner in vivo i samme morfosterpar.

Protocol

Studien ble godkjent av databeskyttelsesansatte ved Oslo Universitetssykehus og Regionalkomiteen for medisinsk og helseforskningsetikk, Sør-Norge 2419/2011. Alle deltakere signerte skriftlig informert samtykke ved inkludering. 1. Forberedelser MERK: En tidslinje for prosedyrene er skissert i figur 1 . <strong class="xfig…

Representative Results

Prøvetakingsmetoden med 4 beholdere er anvendelig i klinisk praksis, og vi har vellykket blodprøver fra 209 mor / spedbarnspar. I 128 av disse oppnådde vi også å måle volumblodstrømmen. Komplett 4-fartøy prøvetaking og god kvalitet flyt målinger av både mor og foster fartøy ble oppnådd i 70 morfoster par ( figur 3 ). I tillegg har vi hittil samlet blod- og placenta-prøver fra 30 preeklamptiske pasienter. Vi har tidligere publisert artikler om h…

Discussion

Mønsteret med moderkreft 4-fartøy er relevant for tre hovedformål. For det første kan det brukes til å studere hvordan bestemte stoffer tas opp av moderkrekken på morssiden og muligens overføres til navlestrømssirkulasjonen og fosteret, som demonstrert av våre glukose- og aminosyreundersøkelser. For det andre er metoden svært relevant for å studere substanser produsert av moderkagen og frigjort til moder- eller føtal sirkulasjon, som demonstrert av progesteron-resultatene. For det tredje kan det være…

Materials

Maternal body composition
Impedance scale	Tanita		or similar
Ultrasound measurements
Sequoia 512 ultrasound machine	Acuson		equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2-6 MHz)
Blood samples
Arerial cannula	BD Medical	682245	or similar
20cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle	Termo	SS-20ES	or similar. 3 needed.
10cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle	Termo	SS-10ES	or similar. 9 needed.
5cc 6% Luer Syringe without Needle	Termo	SS-05S1	or similar. 2 needed.
Arterial blood gas syringe	Radiometer Medical		or similar. 4 needed.
Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge	Greiner Bio-One	450081	(intended for single use).3 needed.
Vacutainer tube 6 mL EDTA	Greiner Bio-One	456043	or similar. Label with sample site. 10 needed.
Vacutainer tube 5 ml LH Lithium Heparin Separator	Greiner Bio-One	456305	or similar. Label with sample site. 5 needed.
Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator	Greiner Bio-One	456089	or similar. Label with sample site. 5 needed.
Vacutainer tube 3 ml  9NC Coagulation sodium citrate 3,2%	Greiner Bio-One	454334	or similar. Label with sample site. 5 needed.
Cryogenic vials, 2.0 mL	Corning	430488	or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed.
Marked trays to transport the syringes			to transport the blood samples in the operation theatre
Rocker			for gentle mixing of the samples
Ice			in styrofoam box
Liquid nitrogen			in appropriate container
Placenta samples
Metal tray
Ice			in styrofoam box
Calibrated scale
Metal ruler
1 M Phosphate buffered saline	Sigma	D1408	or similar. Dilute 10 M to  1M before use
RNA stabilization solution	Sigma	R0901-500ML	or similar
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound	vwr	361603E	or similar
Cryogenic vials, 2.0 mL	Corning	430488	or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed.
Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL	Greiner Bio-One	227,285	or similar. Label with "RNA later", sample site and ID. 2 needed.
Liquid nitrogen			in appropriate container
Fetal body composition
Calibrated scale
Measuring tape