调整在海马Theta乐队体外:从孤立的啮齿动物皮下注射电路记录的方法

Summary

在这里，我们提出了从孤立的整个海马制剂记录节律神经元网络theta和γ振荡的协议。我们描述从海马提取到场，单元和全细胞膜片钳记录的细节以及θ节律的光起搏的实验步骤。

Abstract

该方案概述了从孤立的整个海马，WT和转基因小鼠制备和记录的程序，以及近来对θ振荡研究的方法和应用的改进。提出了分离的海马制剂的简单表征，其中检查内部海马θ振荡器之间的关系以及玉米螟-1（CA1）和亚细胞（SUB）区域的锥体细胞和GABA能中间神经元的活性。总体而言，我们显示分离的海马能够在体外产生内在的θ振荡，海马内产生的节律性可以通过对小白蛋白阳性（PV）中间神经元的光诱导刺激进行精确的操纵。 体外分离的海马制剂提供了独特的机会，使用来自视觉识别的neu的同时场和细胞内膜片钳记录更好地了解θ节奏生成的机制。

Introduction

海马THETA振荡（4 - 12赫兹）之间是在哺乳动物脑节律活动的最主要的形式，并且据信在认知功能中发挥关键作用，如中的情节记忆^1，2，3时空信息和形成处理。虽然一些体内研究，突出THETA调制地方细胞具有空间导航和病变的研究，以及临床证据的关系，支持海马THETA振荡参与记忆形成^4，5，6，相关联的机制视图伴随着海马theta振荡的产生尚未完全了解。早期体内研究表明，θ活性主要依赖于外在振荡器，特别是节奏输入从传入大脑结构，例如隔膜和内嗅皮层^{7，8，9，10。}与海马神经元的属性一起海马神经网络的内部连通- -一种内在因素作用也假定的基于体外观察

Protocol

所有程序均按照麦吉尔大学动物保护委员会和加拿大动物保护委员会批准的议定书和准则进行。

急性海马体外制备

注意:分离完整的海马制剂涉及三个主要步骤:（1）溶液和设备的制备，（2）海马的解剖和（3）建立产生内在θ振荡所需的快速灌注速率系统。在该方案中，及时执行手术 - 从解剖到记录 - 特别重要，因为分离的海马构成如此密集但精细的制剂，其保持体外结构的功能连接性需要非常小心。准备事先确保尽可能早地提供足够的灌注水平以最小化细胞d保持生理功能。

1. 基于蔗糖的人造脑脊液（aCSF）溶液
   1. 准备1X的蔗糖溶液用于解剖和解剖后孵育。将表1中列出的所有组分（CaCl ₂除外）合并成1升去离子水，并在4℃下储存长达2周。
2. 标准aCSF解决方案
   1. 在电生理记录期间准备标准aCSF用于高流量灌注分离的海马。为了使浓缩（5X）的库存aCSF中，溶解在表2中列出的所有部件，除了氯化钙_2，在2升的去离子水，并储存于4℃。
3. 准备设备
   1. 在开始解剖之前，用冰块塑料托盘....

Results

本节说明通过在体外研究小鼠分离的海马制剂中的 θ振荡可以获得的结果的实例。提取分离的海马的解剖程序如图1所示 。使用这种制备，可以在放置多个场电极期间检查内在θ振荡，记录整体活动和将突触输入同步到分离的海马的不同区域和层中的神经元群体（ 图2 ）。提出了同时进行的全细胞膜片钳和细胞外记录的代表性结果，以表征在自发性海马θ振荡期间特定细胞类型的发射和突触特性（ 图3 ），以及在节律活动的光遗传操作图4）。

图1:分离完整的海马准备的解剖程序。
.......

Discussion

虽然来自急性海马切片的电生理记录构成了体外标准技术，但是本文提出的方法与传统方法有很大不同。不同于其中特定细胞层在表面可见并且可以直接检查的薄片制剂，完整的海马制剂更类似于体内构型，其中电极在穿过单个层时下降到目标脑区域中。海马的完整性与局部神经元群体的功能连通性和性质一起保存。这提供了一个复杂而强大的工具，用于调查海马中的小型和大型网络振荡。例如，网络中预接线电路和电池类型特性的组合产生模拟海马重要特征的内在和自发产生的节奏θ和γ振荡体内 mpal活性。使用本方案中提出的方法，可以从啮齿动物脑中快速提取海马，并在快速流动的aCSF环境中保持活力几个小时。基本的电生理学技术很容易应用于研究特定神经元类型的同步活动和突触功能如何影响海马动力学。

我们的程序提供了第一次机会横跨在体外海马的整个隔-时间（背腹轴）系统地探索的局部场电位振荡动力学（见参考文献

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
氯化钠	Sigma Aldrich	S9625
蔗糖	Sigma Aldrich	S9378
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S5761
NaH2PO4 - 磷酸二氢钠	Sigma Aldrich	S8282
硫酸镁	Sigma Aldrich	M7506
氯化钾	Sigma Aldrich	P3911
D-（+）-葡萄糖	Sigma Aldrich	G7528
氯化钙二水合	Sigma Aldrich	C5080
抗坏血酸钠	Sigma Aldrich	A7631-25G
名称	公司	目录号	评论
设备
标准解剖剪刀Fisher	Scientific	08-951-25	脑提取
手术刀柄 #4,14 cm	WPI	500237	脑提取
过滤器镊子，平颚，直（11 厘米）	WPI	500456	出脑
Paragon 不锈钢手术刀刀片 #20	Ultident	02-90010-20	出脑
尖弯曲解剖剪刀	Thermo Fisher Scientific	711999	出脑
特氟龙 （PTFE） 涂层薄刮刀	VWR	82027-534	海马准备
海曼式微刮刀	Fisher Scientific	21-401-25A	海马制备
实验室勺	Fisher Scientific	14-375-20	海马制备
硼硅酸盐玻璃巴斯德移液器	Fisher Scientific	13-678-20A	海马制备
	Droper Fisher Scientific		海马制备
剃须刀片 单刃	VWR	55411-055	海马制备
透镜纸（4 x 6"）	VWR	52846-001	海马制备
玻璃培养皿（100 x 20 mm）	VWR	25354-080	海马制备
冰块塑料托盘;尺寸 30 x 20 x 5 cm	N.A.N.A	.	海马制备
单列式溶液加热器	Warner Instruments	SH-27B	灌注系统
鼓泡的水族箱气石	n.a.n.a	.	灌注系统
Tygon E-3603 管（ID 1/16 OD 1/8）	Fisherbrand	14-171-129	灌注系统
电煎锅	黑色 &Decker	n.a.	灌注系统
95% O2/5% CO2 气体混合物（碳化物）	Vitalaire	SG466204A	灌注系统
玻璃瓶/烧瓶 （4 x 1 L）	n.a.n.a	.	浸
没式记录室	定制设计 （FM）	n.a.	商业替代品
玻璃移液器（1.5/0.84 OD/ID （mm）））	WPI	1B150F-4	电生理学
Hum Bug 50/60 Hz 噪声消除器	Quest Scientific	Q-Humbug	电生理学
Multiclamp 700B 膜片钳放大器	分子装置	MULTICLAMP	电生理学
Multiclamp 700B Commander 程序	分子装置	MULTICLAMP	电生理学
数字/模拟转换器	分子装置	DDI440	电生理学
PCLAMP10	分子装置	PCLAMP10	电生理学
隔振台	Newport	n.a.	电生理
（手动作）	Siskiyou	MX130	电生理学 （LFP）
显微作仪 （自动）	Siskiyou	MC1000e	电生理学 （补丁）
音频监视器	A-M Systems	Model 3300	电生理学
微量移液器/贴片移液器拉拔器	Sutter	P-97	电生理学
定制的正置荧光显微镜	Siskiyou	n.a.	成像
模拟摄像机	COHU	4912-2000/0000	成像
带成像软件的数字图像采集卡	EPIX， Inc	PIXCI-SV7	成像
奥林巴斯 2.5 倍物镜	奥林巴斯	MPLFLN	成像
奥林巴斯 40 倍水浸物镜	奥林巴斯	UIS2 LUMPLFLN	成像
定制发光二极管 （LED） 系统	定制	n.a.	光遗传学刺激（Amhilon等人，2015 年）
名称	Company	目录号	评论
Animals
PV：：Cre （KI） 小鼠	杰克逊实验室	库存编号 008069	允许 PV 中间神经元中 Cre 定向基因表达
组成型条件 Ai9 小鼠 （R26-lox-stop-lox-tdTomato （KI））	Jackson 实验室	库存编号 007905	Express TdTomato 在 Cre 介导的重组后
Ai32 小鼠 （R26-lox-stop-lox-ChR2（H134R）-EYFP	Jackson 实验室	库存 编号 012569	表达暴露于 Cre 后改进的通道视紫红质-2/EYFP 融合蛋白重组酶
PVChY 小鼠	内部育种	n.a.	通过将 PV-Cre 系与 Ai32 小鼠杂交获得的后代 （R26-lox-stop-lox-ChR2（H134R）-EYFP