يصف هذا البروتوكول انتعاش فيروس زيكا المعدية من استنساخ كدنا المعدية ثنائي البلازميد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استنساخ العدوى [كدنا] تسمح للتلاعب الجيني للفيروس، مما يسهل العمل على اللقاحات، المرضية، النسخ المتماثل، انتقال وتطور الفيروس. نحن هنا وصف بناء استنساخ المعدية لفيروس زيكا (زيكف)، الذي يسبب حاليا تفشي المتفجرات في الأمريكتين. لمنع السمية للبكتيريا التي لوحظت عادة مع البلازميدات المستمدة من فلافيروس، أنشأنا نظام البلازميد اثنين الذي يفصل الجينوم في الجين NS1 وأكثر استقرارا من البنيات كامل طول التي لا يمكن استردادها بنجاح دون الطفرات. بعد الهضم وربط للانضمام إلى شظيتين، يمكن أن تتولد كامل الحمض النووي الريبي الفيروسية طول عن طريق النسخ في المختبر مع T7 رنا البلمرة. بعد إليكتروبوراتيون من الحمض النووي الريبي كتب في الخلايا، تم استرداد الفيروس الذي عرضت مماثلة في حركية النمو المختبر وفي الجسم الحي الفوعة والأنماط الظاهرية العدوى في الفئران والبعوض، على التوالي.
المقدمة
فيروس زيكا (زيكف؛ عائلة فلافيفريداي : جنس فلافيفيروس ) هو فيروس منقول بالبعوض الذي وصل إلى البرازيل في 2013-14، وكان مرتبطا بعد ذلك بفاشية واسعة من مرض الحمى التي انتشرت في جميع أنحاء الأمريكتين 1 . وبالإضافة إلى ذلك، تم ربط زيكف مع نتائج المرض الشديد، مثل متلازمة غيلان باريه في البالغين وصغر الرأس في الأجنة والحديثين 2 . ولم يعرف القليل عن زيكف قبل انتشاره السريع في نصف الكرة الغربي. وشمل ذلك نقص الأدوات الجزيئية، مما أعاق البحث الآلي. الأدوات الجزيئية للفيروسات، مثل الحيوانات المستنسخة كدنا المعدية، وتسهيل اللقاح والتنمية العلاجية المضادة للفيروسات، والسماح لتق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحويل واسترداد البلازميدات استنساخ المعدية
- تحويل كلا البلازميدات (بشكل منفصل) باستخدام بروتوكول التحول التجاري (على سبيل المثال ، نب 5 بروتوكول التحول دقيقة) مع بعض التعديلات. كلا البلازميدات تحتوي على ترميز الجينات لمقاومة الأمبيسلين، وبالتالي استخدام الأمبيسلين أو كاربينيسيلين للاختيار. يفضل الكاربنيسيلين، لأنه أكثر استقرارا.
- إزالة الخلايا (انظر المواد الجدول) من -80 درجة مئوية الفريزر وذوبان الجليد على الجليد لمدة 5-10 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بروتوكول الموصوفة هنا يسمح لاستعادة فيروس زيكا المستمدة المستنسخ استنساخ. التلاعب نظام استنساخ العدوى البلازميد اثنين هو واضح عندما يؤديها مع الرعاية، بالمقارنة مع الإصدارات كاملة الطول التي هي غير مستقرة للغاية (لا تظهر البيانات). بعد الهضم وربط قطعتين متميزة، يتم إنتاج رنا توج باستخدام النسخ في المختبر مع بوليميراز T7 الذي هو إليكتروبوراتد ثم إلى خلايا فيرو ( الشكل 1 ). يمكن رصد تسلسل البلازميد الصحيح باستخد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نصف هنا طريقة لاستعادة نظام استنساخ (كدنا) المعدي ثنائي الأجزاء ل ZIKV. تعاني المستنسخة الموصوفة سابقا ل ZIKV إما من التوهين أو تتطلب إضافة الإنترونات ، مما يجعل البلازميدات أكبر ويمنع الإنقاذ في خلايا الحشرات. يمكن استعادة الفيروس المعدي باستخدام نظام استنساخ ثنائي البلازميد في خلايا الثدييات أو الحشرات (البيانات غير معروضة). بالإضافة إلى ذلك ، يتصرف الفيروس المسترد من هذا النظام بشكل مشابه للفيروس من النوع البري في العديد من خطوط الخلايا ، في نموذج الفئران الضعيف للمناعة وفي البعوض.
نظرا لو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
ويود المؤلفون أن يشكروا كريستين بولارد-فيبلمان وميلينا فيسيلينوفيتش وكلوديا روكيرت على مساعدتهم في وصف الفيروس المستخرج من النسخ المستنسخ. وأيد هذا العمل جزئيا من المنح المقدمة من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية، المعاهد الوطنية للصحة في إطار المنح AI114675 (بجج) و AI067380 (جدي).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| NEB مستقرة كفاءةE. قولونية | نيو إنجلاند BioLabs | C3040H | |
| كاربينيسيلين ، ملح ثنائي الصوديوم | مختلف | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20،000 وحدة / مل |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 وحدة / مل |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 وحدة / مل |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 وحدة / مل |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 وحدة / مل |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 وحدة / مل |
| illustra TempliPhi 100 طقم تضخيم | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel و PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 وحدة / مل |
| الفوسفاتيز القلوي ، معوي العجل (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 وحدة / مل |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400،000 وحدة / مل |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| خلايا Vero | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 نظام التثقيب الكهربائي عالي الإنتاجية | BTX | 45-0423 | الآلات الأخرى مقبولة. |
| مرق LB مع أجار (ميلر) | يمكن أيضا صنع Sigma | L3147 | . |
| مرق رائع | سيجما | T0918 | يمكن أن يكون محلي الصنع أيضا. |
| طبق | Celltreat | 229693 | |
| أنابيب الثقافة | VWR International | 60818-576 | |
| قوارير T75 | Celltreat | 229340 | |
| T182 قوارير | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 مع L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM مع L-glutamine و 4.5 جم / لتر جلوكوز | Corning | 10-017-CV | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| مسحوق التراجاكانث | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| الإيثانول المشوه | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 لوحة | بئرCelltreat | 229106 | |
| 12 بئر | لوحة Celltreat | 229111 | |
| تسلسل Oligos | IDT | انظر الجدول 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | الطرق الأخرى مقبولة. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | طرق أخرى مقبولة. |
| كيوبيت RNA HS الفحص كيت | ThermoFisher | Q32852 | الطرق الأخرى مقبولة. |
| تختلف خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية | N / A | هذا ضروري لعمل الفيروسات الحية. |
المراجع
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guill....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
