Dieses Protokoll beschreibt die Wiederherstellung des infektiösen Zika-Virus aus einem zwei-Plasmid-infektiösen cDNA-Klon.
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Methodenartikel
Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Infektiöse cDNA-Klone erlauben die genetische Manipulation eines Virus und erleichtern so die Arbeit an Impfstoffen, Pathogenese, Replikation, Übertragung und Virusentwicklung. Hier beschreiben wir den Aufbau eines infektiösen Klons für Zika Virus (ZIKV), der derzeit einen explosiven Ausbruch in Nord- und Südamerika verursacht. Um Toxizität gegenüber Bakterien zu verhindern, die häufig mit Flavivirus-abgeleiteten Plasmiden beobachtet wird, erzeugten wir ein Zwei-Plasmid-System, das das Genom am NS1-Gen trennt und stabiler ist als Volllängen-Konstrukte, die ohne Mutationen nicht erfolgreich gewonnen werden konnten. Nach der Verdauung und Ligation, um die beiden Fragmente zu verbinden, kann eine Volllängen-Virus-RNA durch in vitro- Transkription mit T7-RNA-Polymerase erzeugt werden. Nach der Elektroporation von transkribierter RNA in Zellen wurde das Virus gewonnen, das ähnliche In-vitro- Wachstumskinetiken und In-vivo- Virulenz- und Infektions-Phänotypen in Mäusen und Mücken zeigte.
Einleitung
Zika-Virus (ZIKV, Familie Flaviviridae : Gattung Flavivirus ) ist ein Moskito-getragenes Flavivirus, das in Brasilien in den Jahren 2013-14 angekommen ist und anschließend mit einem massiven Ausbruch der fiebrigen Krankheit verbunden war, die sich in ganz Amerika verbreitete 1 . Darüber hinaus wurde ZIKV mit schwerwiegenden Erkrankungen wie dem Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen und Mikrozephalie bei Föten und Neugeborenen verknüpft 2 . Wenig war über ZIKV vor seiner schnellen Verbreitung in der westlichen Hemisphäre bekannt. Dazu gehört ein Mangel an molekularen Werkzeugen, was die mechanistische ....
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Protokoll
1. Transformation und Wiederherstellung von infektiösen Klonplasmiden
- Transformieren Sie beide Plasmide (getrennt) unter Verwendung eines kommerziellen Transformationsprotokolls ( z. B. NEB 5 Minute Transformation Protocol) mit einigen Modifikationen. Beide Plasmide enthalten ein für die Ampicillinresistenz kodierendes Gen, daher verwenden sie Ampicillin oder Carbenicillin zur Selektion. Carbenicillin wird bevorzugt, da es stabiler ist.
- Entfernen Sie die Zellen (siehe Materialtabelle) von -80 ° C Gefrierschrank und tauen Sie auf Eis für 5-10 min. Prewarm Lysogeny Brühe (LB) (mit 10 g / l NaCl und 25 μg / ml Carbenicillin,....
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Ergebnisse
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Wiederherstellung von infektiösem Klon-abgeleiteten Zika-Virus. Das Manipulieren des Zwei-Plasmid-Infektios-Klonsystems ist einfach, wenn es mit Sorgfalt durchgeführt wird, im Vergleich zu Volllängen-Versionen, die sehr instabil sind (Daten nicht gezeigt). Nach der Verdauung und Ligation der beiden verschiedenen Stücke wird eine Capped-RNA unter Verwendung einer in vitro- Transkription mit T7-Polymerase hergestellt, die dann in Vero.......
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Diskussion
Hier beschreiben wir eine Methode zur Rückgewinnung eines bipartiten infektiösen cDNA-Klonsystems für ZIKV. Zuvor beschriebene Klone für ZIKV leiden entweder unter einer Abschwächung oder erfordern die Zugabe von Introns, wodurch die Plasmide größer werden und die Rettung in Insektenzellen verhindert wird. Infektiöse Viren können mit dem Zwei-Plasmid-Klonsystem entweder in Säugetier- oder Insektenzellen wiedergefunden werden (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus verhalten sich Viren, die aus diesem System gewonnen werden.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren danken Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic und Claudia Rückert für ihre Unterstützung bei der Charakterisierung des vom Klon abgeleiteten Virus. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des Nationalen Instituts für Allergie und Infektionskrankheiten, NIH unter den Stipendien AI114675 (BJG) und AI067380 (GDE) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Dinatriumsalz | verschiedene | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20.000 Einheiten/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20.000 Einheiten/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10.000 Einheiten/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20.000 Einheiten/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20.000 Einheiten/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20.000 Einheiten/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplifikationskit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel und PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Alkalische Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1.000 Einheiten/ml |
| Alkalische Phosphatase, Kälberdarm (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10.000 Einheiten/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400.000 Einheiten/ml |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| ATCC | CCL-81 | ||
| ECM 630 Hochdurchsatz-Elektroporationssystem | BTX | 45-0423 | Andere Geräte sind akzeptabel. |
| LB Bouillon mit Agar (Miller) | Sigma | L3147 | Kann auch hausgemacht werden. |
| Grandiose Brühe | Sigma | T0918 | Kann auch hausgemacht werden. |
| Petrischale | Celltreat | 229693 | |
| Kulturröhrchen | VWR International | 60818-576 | |
| T75 Kolben | Celltreat | 229340 | |
| T182 Kolben | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 mit L-Glutamin | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM mit L-Glutamin und 4,5 g/L Glukose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetales Rinderserum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Traganth Pulver | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol denaturiert | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6-Well-Platte | Celltreat | 229106 | |
| 12-Well-Platte | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | siehe Tabelle 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | andere Methoden sind akzeptabel. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | andere Methoden sind akzeptabel. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | andere Methoden sind akzeptabel. |
| Biosicherheitswerkbank der Klasse II | variiert | N/A | Dies ist für die Arbeit mit lebenden Viren erforderlich. |
Referenzen
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guill....
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Nachdrucke und Genehmigungen
