Her, beskriver vi en teknik, protein film infrarød elektrokemi, som tillader immobiliseret redox proteiner studeres hjælp under direkte elektrokemisk kontrol på en kul elektrode. Infrarød spektre af en enkelt protein prøve kan optages på en række anvendte potentialer og under en række løsning betingelser.
Forståelse af redox proteiner krav metoder, som giver præcis kontrol over redox kemi centre inden for protein. Teknikken med protein film elektrokemi, hvor et protein er immobiliseret på en elektrode overflade, sådan at elektroden erstatter fysiologiske electron donorer eller acceptorer, har givet funktionelle indblik i en vifte af forskellige redox-reaktioner proteiner. Fuld kemiske forståelse kræver elektrokemiske kontrol skal kombineres med andre teknikker, som kan tilføje ekstra struktur- og mekanistiske indblik. Her viser vi en teknik, protein film infrarød elektrokemi, som kombinerer protein film elektrokemi med infrarød spektroskopiske prøvetagning af redox proteiner. Teknikken bruger en multiple-refleksion svækkede samlede Reflektionsgraden geometri for at sonde en redox protein immobiliseret på et højt areal kønrøg elektrode. Indarbejdelse af denne elektrode i en flow-celle tillader løsning pH eller opløste koncentrationer ændres under målingerne. Dette er særligt effektive i håndteringen af redox enzymer, hvor hurtig katalytiske omsætning kan opretholdes og kontrolleret på elektroden tillader spektroskopiske observation af langlivede mellemliggende arter i den katalytiske mekanisme. Vi demonstrere teknik med eksperimenter med E. coli hydrogenase 1 under omsætning (H2 oxidation) og ikke-omsætning betingelser.
En central udfordring i studiet af protein funktion indebærer udvikling af i situ metoder, der giver mulighed for direkte observation af proteiner udfører deres fysiologiske roller, enten i vivo eller ved hjælp af isolerede protein prøver. Dette kræver integration af kontrol eller udløse processer i eksperimentelle procedurer og anvendelse af kombinerede teknikker, der tillader både reaktivitet skal vurderes, og enkelte kemiske trin under protein funktion skal måles, samtidigt. I tilfælde af redox proteiner svarer dette ofte til at kombinere elektrokemiske teknikker, som netop kontrollere den anvendte potentiale, men giver ingen direkte kemiske oplysninger, med spektroskopiske teknikker, der er følsomme over for kemisk-specifikke ændringer forbundet med protein funktion. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry er en generel betegnelse for en række koblede elektrokemiske og spektroskopiske metoder, som omfatter en række teknikker, spektroskopiske og elektrokemiske kontrolniveauerne. Mange proteiner kan udveksle elektroner med kunstige, opløseligt electron donorer og acceptorer og dette er blevet udnyttet i undersøgelser, der anvender små molekyler for at mægle elektron overførsel, herunder kobling med UV-synlige,4,5 , 6 , 7 magnetiske cirkulære dichroism8 og infrarød5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. I et begrænset antal tilfælde har det været muligt at udnytte uformidlede, diffusion-kontrollerede elektron udveksling mellem proteiner og elektroder. 15 , 16
For katalytiske reaktioner udført af redox enzymer, løsning elektrokemi tilgange til stede en klar ulempe. Diffusion-kontrollerede elektron overførsel via redox mæglere i løsning er tilbøjelige til at blive hastighedsbegrænsning. Kinetiske og mekanistiske information om enzymet kan gå tabt eller i det mindste blive vanskeligt at deconvolute fra diffusion artefakter som følge af den eksperimentelle metode. Direkte og uformidlede elektrokemiske kontrol er derfor et vigtigt redskab for studiet af redox proteiner og enzymer. Teknikken med protein film elektrokemi (PFE) beskæftiger elektrode-immobiliseret redox proteiner, på en sådan måde, at elektroner er overført direkte til eller fra redox cofaktorer inden for protein som elektroden er polariseret på en række potentialer. 17 , 18 , 19 PFE er af ganske særlig værdi for studiet af oxidation eller reduktion reaktioner katalyseret af redox enzymer, som interfacial elektron overførsel kan opnås med en meget høj hastighed. For eksempel, blev electrocatalytic omsætning sats af nikkel-jern ([NiFe]) hydrogenase fra Allochromatium vinosum målt af Løbeunderlag som ca 1.000-10.000 s1 for H2 oxidation. 20 elektrode potentielle fungerer som en udløser til Drej katalyse ‘on’ eller ‘off’ og electrocatalytic aktuelle rapporter på enzymaktiviteten. Løbeunderlag er derfor en værdifuld metode til at analysere reaktiviteten af komplekse enzymer, der er intimt afhængige potentiale, såsom reaktioner di-jern aktive site [Lasse]-hydrogenases med CO og O2,21 eller potentiale-induceret inaktivering reaktioner af hydrogenases,22 kulilte dehydrogenase,23 og andre komplekse redox enzymer. 24
Den vigtigste hindring for kombinerer spektroskopiske teknikker med direkte elektrokemisk kontrol af Løbeunderlag udspringer af den lave overfladedækning af redox enzymer, om 1-2 pmol cm-2 for [NiFe] hydrogenase fra A. vinosum, 20 i forhold til i situ overflade videnskabelige studier af lille molekyle adsorbates på bulk metal elektroder. Dette er en udfordring for følsomheden af de spektroskopiske målinger. Flere spectroelectrochemical metoder er blevet rapporteret til at studere immobiliseret redox proteiner på en række forskellige elektroder: UV-synlige spektroskopi på gennemsigtige metaloxid elektroder; 25 , 26 , 27 fluorescens spektroskopi på guld elektroder; 28 , 29 overflade forbedret infrarød absorption (SEIRA) spektroskopi på guld elektroder; 30 , 31 , 32 , 33 og overflade øget Raman spektroskopiske teknikker, hovedsagelig på sølv elektroder. 34 , 35
Her beskriver vi en metode for kobling PFE med IR-spektroskopi, i en teknik kendt som protein film infrarød elektrokemi (PFIRE). 36 den PFIRE metode undersøgelser redox enzymer immobiliseret på et højt areal carbon arbejder elektrode sammenholdt med en svækket samlede Reflektionsgraden IR (ATR-IR) geometri, at udnytte lethed af adsorptionen af en række proteiner på carbon overflader. IR-spektroskopi er nyttig i undersøgelser af redox enzymer og proteiner, som mange små molekyler, ligander og cofaktorer har diagnostisk absorptioner, der kan bruges til at vurdere reaktivitet, bindende, hæmning og redox stat. Eksempler omfatter binding af nej til jern-svovl centre,37 undersøgelse af flavoproteins,38,39,40 små molekyler binding til hæm Centre etc. 41 the ATR-IR geometri giver mulighed for opførelse af en optimeret tre-elektrode (spectro) elektrokemisk celle42 og derfor giver fremragende elektrokemiske kontrol. Løsning modstand og potentielle drift er minimeret ved at placere en referenceelektrode tæt på arbejde elektrode. Der anvendes høj areal counter elektroder, der er kompatible med høj electrocatalytic strømme produceret af hurtig enzym omsætning på arbejde elektrode. Strømmen af løsning gennem cellen spectroelectrochemical giver mulighed for facile kontrol over koncentrationen af substrater, hæmmere og pH. 36 , 43 , 44 den PFIRE metode tillader derfor IR spektre at være optaget i situ under vedvarende enzym electrocatalysis. 36 , 44 PFIRE er også i stand til at levere kemiske oplysninger i mangel af katalytisk aktuelle,43 i modsætning til PFE hvor kan det være svært at udtrække oplysninger fra ikke-katalytiske processer i redox enzymer. 45 , 46
Vi har vist PFIRE metoden til undersøgelse af electrocatalytic H2 oxidation af [NiFe] hydrogenases, som indeholder iboende CO og KN ligander koordineret til Fe på et bimetal aktive site. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases er derfor særligt velegnet til at studere ved PFIRE. Metoden PFIRE indeholder oplysninger om de arter, der er til stede under steady-state omsætning, og derfor giver afgørende mekanistiske indblik ud over rigdommen af litteratur på IR-spektroskopi af hydrogenases uden eksperimentelle kontrol over omsætning. 47 , 48 Dyer og kollegaer har ansat tidsopløst IR metoder til undersøgelse af NiFe hydrogenases,49,50,51 bruge en lys udløser til enten anvende en lille negativ potentielle skridt (via brugen løsning mæglere og en “bur” elektron kilde) eller photolyse et bundet hydrid. Selv om metoden PFIRE ikke kan på nuværende tidspunkt, giver tidsopløsning at matche disse målinger,40 det giver mulighed for undersøgelse af både reduktiv og oxidativ katalytiske processer, adgang til en række veldefinerede potentialer og gratis fra massetransporten begrænsninger.
Metoden PFIRE er adskilt fra SEIRA undersøgelser af redox proteiner, som også bruger en ATR-IR geometri og ansætte en nanoskala-ru metal elektrode til at forbedre IR absorbansen af molekyler adsorberet på elektrode overflade. 30 SEIRA er en yderst værdifuld teknik til at studere Membranproteiner, især adsorberet på eller inden for mimetiske membran arkitekturer,32 , men behovet for en metal elektrode kan begrænse substrat og inhibitor reaktivitet elektrode støtte til små molekyler som CO, KN-–, CO2 osv. Proton reduktion og selvsamlede éncellelag desorption kan være problematisk på metaloverflader på meget negative potentialer, er1,52 selv om enzymet electrocatalysis på ubeskyttede metal elektroder blevet rapporteret. 53 , 54 en ulempe ved PFIRE i forhold til SEIRA er relativ vanskeligheden ved at indarbejde Membranproteiner i native eller mimetiske membran arkitekturer. Men den relative kemisk inaktive af Kulelektroder konkurrerende lille molekyle aktivering reaktioner gør PFIRE en fremragende teknik til at studere enzymet electrocatalysis, især i lav-potentiale domæne relevante for biologiske redox processer som proton reduktion af hydrogenases. 1 , 43
Formålet med denne artikel er at indføre metoden PFIRE som en teknik til at studere elektrode-immobiliseret redox proteiner, med NiFe hydrogenase 1 (Hyd1) fra Escherichia coli, som eksempel. Overvejelser af prøveforberedelse, kravet om godt substrat flow og data håndtering diskuteres. PFIRE er et bredt gældende teknik, velegnet til at undersøge enhver redox protein (med karakteristiske IR absorptioner), der kan være adsorberet på Kulelektroder, enten direkte eller ved hjælp af overflade ændring, således at det kan udveksle elektroner med den elektrode.
PFIRE er et bredt gældende IR spektroskopiske teknik til håndtering af elektrode-immobiliseret redox proteiner. Især kan electrocatalytic reaktioner af redox enzymer blive aftestede på hurtig omsætning betingelser. PFIRE metoden bygger på direkte elektrokemisk kontrol af teknikken med Løbeunderlag, som giver ingen direkte strukturelle oplysninger, og par det til IR-spektroskopi på en kul elektrode. PFIRE tilgangen dermed tilføjer kemiske indsigt til de foreliggende oplysninger fra elektrokemi alene og er yderst velegnet til undersøgelse af redox proteiner og enzymer involveret i lille molekyle bindende og aktivering. Derudover kan PFIRE give oplysninger om potentiale-afhængige strukturelle ændringer i proteiner i mangel af katalytiske omsætning. Sådanne ikke-omsætning elektron overførsel begivenheder er ofte vanskeligt at opdage ved hjælp af ‘standard’ anvendelser af Løbeunderlag, selvom udvidelse af Løbeunderlag til Fourier-omdannet AC voltammetry har været brugt med stor succes. 45 , 46
Metoden PFIRE er principielt egnet til undersøgelse af eventuelle redox protein, der kan studeres ved hjælp af Løbeunderlag. Derfor, som med Løbeunderlag, protein adsorption er et kritisk skridt til et vellykket PFIRE eksperiment. I denne protokol beskriver vi en anvendelse af den PFIRE teknik ved hjælp af E. coli Hyd1 som et case study. 36 , 43 men vi har også anvendes PFIRE teknik i cytoplasmatisk regulerende hydrogenase fra R. eutropha,44 og flavin mononucleotide adsorberet på kønrøg. 40 i alle disse tilfælde, simple fysiske adsorption til uændret høj areal carbon black (som beskrevet i denne protokol) giver en overflade dækning af protein, der er høj nok til at optage god kvalitet IR spektre med en høj signal-støj-forhold. I tilfælde hvor sådanne høje niveauer af adsorption ikke kan opnås kan det være nødvendigt at ændre overfladen af kulstof partikler, for eksempel at tillade kovalente fastgørelse af protein elektrode overflade. 60 , 61 , 62 brug af et handskerum til PFIRE målinger er kun strengt nødvendigt, når man studerer prøver, der skal håndteres anaerobt. Men i praksis den ekstremt konstant og lav (< 80 ° C dugpunkt) niveauer af vanddamp fra handskerum atmosfære Giv højt signal-støj-niveau, der tillader udvinding af meget små absorptioner. 44 i mange tilfælde en anaerobt miljø, som den, der leveres af handskerum, er også ønskelig for elektrokemisk måling (integreret med teknikken, PFIRE) for at undgå nuværende på grund af O2 reduktion på arbejde elektrode.
IR absorptioner bulk vand, eksperimentelle buffere og carbon partikler som prøve er adsorberet alle bidrage betydeligt til de eksperimentelle spektre og kunne overlapper bands af interesse, især i akrylamid I, II og III regioner af den spektrum. 63 regionen akrylamid indeholder også oplysninger fra økologisk arter som biokemi eller nicotinamid cofaktorer, som substrater og produkter af mange oxidation og reduktion af reaktioner. I forbindelse med NiFe hydrogenases, νCO og νKN bands af det aktive sted falder i et relativt klart område af spektret og så PFIRE teknikken er meget velegnet til studiet af disse enzymer. I andre tilfælde, men kan forskellen spectra kombineret med isotopiske mærkning tilgange være nødvendigt at isolere ændringer som følge af de immobiliserede protein. Lignende metoder har været anvendt til at identificere, for eksempel, protonation ændringer, strukturelle rearrangementer og studere Michaelis-Menten komplekser ved hjælp af IR-spektroskopi. 64 , 65 , 66 PFIRE er således, ikke begrænset til undersøgelse af hydrogenases men kan anvendes til enhver redox protein, der indeholder (eller hvis substrater, produkter eller hæmmere indeholder) grupper med diagnostiske IR-aktive vibrationer; kulilte dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins,40 og formate dehydrogenases, f.eks.
Den relaterede teknik, SEIRA, er meget velegnet til undersøgelse af membran-associerede proteiner i en biomimetiske miljø. 32 SEIRA er en tilpasning af IR-spektroskopi, der også bruger en ATR-IR konfiguration, og gør brug af en overflade enhancement effekt, der forstærker IR absorbansen af molekyler ligger tæt på (inden for et par nm) overfladen af ATR prisme (IRE). SEIRA er derfor udsøgt følsomme spektrale ændringer, der forekommer inden for den adsorberede protein og membran arkitektur og er relativt fri for konkurrerende signaler fra opløsningsmiddel og substrater-hæmmere er til stede i løsning. Dette er lidt i modsætning til den PFIRE teknik beskrevet her, som bygger på en væsentligt større indtrængningsdybde over overfladen af IRE (~ 1 µm), hvilket betyder, at PFIRE er mere følsomme over for substrater, produkter eller hæmmere præsentere i løsning. Denne øget følsomhed over for ‘bulk’ opløsningsmiddel kan være en fordel; Hvis underlaget eller produkt kan observeres direkte af IR, rapport PFIRE spektre om begge steady state kinetik af langlivet aktiv arter og associeret produkt dannelse under electrocatalysis. 69 evnen til at iagttage steady state koncentrationer af substrat og produkt vil være særlig værdifuld for enzymer såsom kulilte dehydrogenase (som katalyserer den reversible oxidation af CO til CO2, en stærk IR absorber) eller formate dehydrogenase (som katalyserer den reversible oxidation af formate til CO2).
PFIRE er for øjeblikket begrænset til steady-state kinetiske undersøgelser af enzymet electrocatalysis på grund af de makroskopiske Kulelektroder bruges til at koncentrere sig enzym på overfladen af en VREDE for dataindsamling i og ATR-IR geometri. I denne henseende er PFIRE undersøgelser af NiFe hydrogenases supplerer arbejdet i Dyer og kollegaer,49,50 , der bruger lys-udløst forbigående absorption IR-spektroskopi studere sub omsætning kinetik. Arbejdes til miniaturize spectroelectrochemical celle,40 og med brug af microelectrodes tidsopløsning på rækkefølgen mikrosekunder bør være opnåelige. Dette vil aktivere undersøgelse af sub omsætning kinetik for enzymer med omsætning frekvenser op til ca 100-500 s-1, og vil sætte studiet af både reduktiv og oxidative processer.
Samlet set er PFIRE en spektroskopisk teknik, der giver mulighed for kemiske karakterisering af electrocatalytic reaktioner af redox enzymer under steady state-betingelser. Metoden PFIRE tillader flere kemiske og elektrokemiske titreringer skal udføres på den samme prøve, enzym, da de høje areal elektroder anvendes giver en solid adsorption af protein og ATR-IR geometri tillader letkøbt løsning exchange. Evnen til at indsamle sådanne strukturelle oplysninger i situ under enzym funktion er et uvurderligt værktøj for den bredere bioelectrochemistry samfund.
The authors have nothing to disclose.
K.A.V. og P.A.A. arbejde blev støttet af European Research Council (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), teknik og naturvidenskab forskning Rådet IB katalysator award EP/N013514/1, og bioteknologi og biologiske videnskaber forskning Rådet (BB/L009722/1 og BB/N006321/1). R.H. var støttet af Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, og Lincoln College, Oxford. Forfatterne anerkender Mr. Charlie Jones, Mr. Charlie Evans og personale på det mekaniske værksted (Institut for kemi) om bistand til design og fremstilling af spectroelectrochemical celler, der anvendes i dette arbejde.
Spectrometer | Agilent | 680-IR | with an external MCT detector |
ATR accessory | Pike Technologies | GladiATR | Customised for use with a 5-reflection Si IRE |
Glovebox | Glove Box Technology Ltd. | N/A | Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement |
KBr window | Crystran | Custom | To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer |
Additional optics | Agilent | N/A | Components from a PM-IRRAS accessory |
Silicon IRE | Crystal GmbH | Custom | Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle |
Potentiostat | Metrohm | Autolab PGSTAT 128N | |
Nova 10.1 | Metrohm | Software for controlling the potentiostat | |
Peristaltic pump | Williamson Manufacturing Company Ltd | QL-1000-024-300 | |
Pt wire | Surepure Chemetals | 3272 | 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter |
Carbon rod | WH Smith | 30729209 | 0.7 mm HB pencil lead |
Carbon black | Cabot Corporation | Black Pearls 2000 | |
Ultrasonic bath | Ultrawave | U100 | 35 W |
Centrifugal filter | Merck Millipore | UFC5050BK | Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5452000018 | MiniSpin |
NaCl | Sigma | 71376 | |
H2SO4 | Fisher | S/9240/PB17 | |
HNO3 | Fisher | N/2300/PB17 | |
silicone sealant | Cow Corning Toray Co., Ltd. | SE 4486 | |
Carbon paper | Toray | TGP-H-030 | |
H2 gas | BOC | ||
N2 gas | BOC | ||
OriginPro 2015 | OriginLab | Data analysis/graphing software | |
Resolutions Pro 4.0 | Varian | Software for controlling FTIR spectrometer |