Her beskriver vi en teknikk, protein filmen infrarød elektrokjemi, hvilke innrømmer immobilisert redoks proteiner til studeres tyske under direkte elektrokjemiske føring en karbon elektrode. Infrarød spektra av et enkelt protein utvalg kan registreres på en rekke anvendt potensialer og under en rekke løsning forhold.
Forstå kjemi redox proteiner krav metoder som gir presis kontroll over redoks sentre i protein. Teknikken av protein filmen elektrokjemi, der et protein er immobilized på en elektrode underlag slik at elektroden erstatter fysiologiske elektron givere eller acceptors, har gitt funksjonelle innsikt i redoksreaksjoner på en rekke forskjellige proteiner. Kjemikalier forståelse krever elektrokjemiske kontroll kombineres med andre teknikker som kan legge ekstra strukturelle og mekanistisk innsikt. Her viser vi en teknikk, protein filmen infrarød elektrokjemi, som kombinerer protein filmen elektrokjemi med infrarød spektroskopiske utvalg av redoks proteiner. Teknikken bruker en flere-refleksjon dempes totale refleksjon geometri for å undersøke en redoks protein immobilisert på en høy areal sot elektrode. Inkorporering av denne elektroden en flyt celle kan løsningen pH eller stoff konsentrasjoner endres under mål. Dette er spesielt kraftig i adressering redoks enzymer, hvor rask katalytisk omsetning kan vedvarende og kontrollert på elektroden tillater spektroskopiske observasjon av varige mellomliggende arter i katalytisk mekanismen. Vi demonstrere teknikken med eksperimenter på E. coli hydrogenase 1 under omsetning (H2 oksidasjon) og ikke-omsetning forhold.
En viktig utfordring i studiet av protein funksjonen innebærer utvikling av i situ metodene som tillater direkte observasjon av proteiner utføre sine fysiologiske roller, enten i vivo eller bruke isolert protein prøver. Dette krever integrering av kontroll eller utløse prosesser i eksperimentell prosedyrer og bruk av kombinerte teknikker som tillater både den reaktivitet skal vurderes, og kjemiske enkelttrinn under protein funksjonen skal måles, samtidig. I tilfelle av redoks proteiner at dette ofte tilsvarer kombinere elektrokjemiske teknikker, som nøyaktig kontroll anvendt potensial, men gir ingen direkte kjemiske informasjon, med spektroskopiske teknikker som kjemisk-spesifikke endre forbundet med protein-funksjonen. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry er en generell term for en rekke kombinert elektrokjemiske og spektroskopiske metoder som omfatter en rekke spektroskopiske teknikker og elektrokjemiske kontrollnivåene. Mange proteiner kan utveksle elektroner med kunstige, løselig elektron givere og acceptors og dette har blitt utnyttet i studier som bruker små molekyler for å megle elektron overføring, inkludert kobling med UV-synlig,4,5 , 6 , 7 magnetiske sirkulære dichroism8 og infrarød5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. I noen tilfeller har det vist mulig å utnytte unmediated, diffusjon-kontrollert elektron utveksling mellom proteiner og elektroder. 15 , 16
For katalytisk reaksjoner utført av redoks enzymer, løsning elektrokjemi tilnærminger finnes en klar ulempe. Diffusjon-kontrollerte elektron overføring via redoks meklarar i løsningen er trolig bli begrense frekvensen. Informasjon om enzymet Kinetic og mekanistisk kan gå tapt, eller minst bli vanskelig å deconvolute fra diffusjon gjenstander fra experimental metoden. Direkte, unmediated elektrokjemiske kontroll er derfor et viktig verktøy for studiet av redoks proteiner og enzymer. Teknikken av protein filmen elektrokjemi (PFE) benytter elektrode-immobilisert redoks proteiner, slik at elektroner overføres direkte til eller fra redoks kofaktorer i protein som elektroden er polarisert på en rekke potensialer. 17 , 18 , 19 PFE er av spesiell verdi for studiet av oksidasjon eller reduksjon reaksjoner katalysert av redoks enzymer, som interfacial elektron overføring kan oppnås med en svært høy hastighet. For eksempel ble electrocatalytic omløpshastighet av nikkel-jern ([NiFe]) hydrogenase fra Allochromatium vinosum målt ved PFE som ca 1000-10.000 s−1 for H2 oksidering. 20 elektroden potensielle fungerer som en utløser for katalyse “på” eller “off” og electrocatalytic gjeldende rapporter om enzym aktivitet. PFE er derfor en nyttig metode for å analysere reaktivitet av komplekse enzymer som nært potensial, som reaksjoner av di-jern aktiv stedet for [FeFe]-hydrogenases med CO og O221 eller potensial-indusert inaktivering reaksjoner på hydrogenases,22 karbonmonoksid dehydrogenase,23 og andre komplekse redoks enzymer. 24
Det viktigste hinderet for kombinere spektroskopiske teknikker med direkte elektrokjemiske kontroll by av PFE oppstår i lav dekning av redoks enzymer, på 1-2 pmol cm-2 for [NiFe] hydrogenase fra A. vinosum, 20 i forhold til i situ overflaten vitenskap studier av små molekyl adsorbates på bulk metall elektroder. Dette utgjør en utfordring for følsomhet for spektroskopiske målingen. Flere spectroelectrochemical metoder er rapportert for å studere immobilisert redoks proteiner på en rekke forskjellige elektroder: UV-synlig spektroskopi på gjennomsiktig metalloksid elektroder; 25 , 26 , 27 fluorescens spektroskopi på gull elektroder; 28 , 29 overflaten forbedret infrarød absorpsjon (SEIRA) spektroskopi på gull elektroder; 30 , 31 , 32 , 33 og overflaten forbedret Raman spektroskopiske teknikker, hovedsakelig på sølv elektroder. 34 , 35
Her beskriver vi en metode for kopling PFE med IR spektroskopi, i en teknikk kjent som protein filmen infrarød elektrokjemi (PFIRE). 36 the PFIRE metoden studier redoks enzymer immobilisert på en høy areal karbon arbeider elektrode sammen med en dempes totale refleksjon IR (ATR-IR) geometri, utnytte enkel opptak av en rekke proteiner til karbon overflater. IR spektroskopi er nyttig i studier av redoks enzymer og proteiner som mange små molekyler, ligander og kofaktorer har diagnostiske absorbances som kan brukes til å vurdere reaktivitet, binding, hemming og redox. Eksempler binding av nei til jern-svovel sentre,37 studiet av flavoproteins,38,39,40 små molekyl binding til måltema sentre etc. 41 the ATR-IR geometri tillater bygging av en optimalisert tre elektrode (spectro) elektrokjemiske cellen42 og derfor gir utmerket elektrokjemiske kontroll. Løsning motstand og potensielle drift minimeres ved å plassere en referanse elektrode nær arbeider elektroden. Høy overflate telleren elektrodene brukes som er kompatible med høy electrocatalytic strøm produsert av rask enzym omsetning på arbeider elektroden. Flyten av løsning gjennom spectroelectrochemical cellen gir lettvinte kontroll over konsentrasjonen av underlag, hemmere og pH. 36 , 43 , 44 the PFIRE metoden kan derfor IR spectra å være registrert i situ under vedvarende enzymet electrocatalysis. 36 , 44 PFIRE er likeledes dugelig av kjemiske informasjon i fravær av katalytisk oppdatert43 i motsetning til PFE hvor det kan være vanskelig å trekke ut informasjon fra ikke-katalytiske prosesser i redoks enzymer. 45 , 46
Vi har vist PFIRE metoden for studiet av electrocatalytic H2 oksidasjon av [NiFe] hydrogenases, som inneholder innebygde CO og CN ligander koordinert til Fe hos en bimetall aktiv. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases er derfor spesielt godt egnet til å studere ved PFIRE. Metoden PFIRE gir informasjon om arter som er under stabil omsetning, og derfor gir avgjørende mekanistisk innsikt i tillegg til mengde litteratur på IR spektroskopi av hydrogenases uten eksperimentelle kontroll over omsetning. 47 , 48 Dyer og medarbeidere har ansatt tid-løst IR metoder å studere av NiFe hydrogenases,49,50,51 bruker en lett utløse enten bruke et lite negative potensielle skritt (via bruk løsning meglere og en “bur” elektron kilde) eller photolyse en bundet hydrid. Selv om metoden PFIRE kan foreløpig gi tid løsning å matche disse målingene,40 det tillate studie av både reductive og oksidativt katalytiske prosesser, på en rekke veldefinerte potensialer og fri fra masse transport begrensninger.
Metoden PFIRE er forskjellig fra SEIRA studier av redoks proteiner, som også bruker en ATR-IR geometri og ansette en nanoskala-sklifri metall elektrode å forbedre IR absorbansen molekyler adsorbert på elektroden overflaten. 30 SEIRA er en svært verdifull teknikk for å studere membran proteiner, særlig adsorbert på eller innenfor mimetic membran arkitekturer,32 men behovet for en metall elektrode kan begrense det underlag og hemmer omfanget på grunn av reaktivitet av elektroden støtte mot små molekyler som CO, CN–, CO2 osv. Proton reduksjon og selv montert monolayer desorpsjon kan være problematisk på metallflater på svært negativt potensialene, er1,52 selv om enzymet electrocatalysis på ubeskyttet metal elektrodene rapportert. 53 , 54 en ulempe av PFIRE i forhold til SEIRA er relativ vanskeligheten med å innlemme membran proteiner i native eller mimetic membran arkitekturer. Men gjør den relative kjemiske inertness av karbon elektrodene til konkurrerende små molekyl aktivisering reaksjoner PFIRE en glimrende teknikk for å studere enzymet electrocatalysis, spesielt i lav potensial domenet relevant for biologiske redoks prosesser som proton reduksjon av hydrogenases. 1 , 43
Målet med denne artikkelen er å innføre metoden PFIRE som en teknikk for å studere elektrode-immobilisert redoks proteiner, bruke NiFe hydrogenase 1 (Hyd1) fra Escherichia coli som et eksempel. Betraktninger av prøven forberedelse, behovet for god substrat flyt og data håndtering drøftes. PFIRE er en bredt aktuelt teknikk, velegnet til studere noen redoks protein (med karakteristiske IR absorbances) som kan være adsorbert på karbon elektroder, enten direkte eller ved hjelp av overflaten endring, slik at det kan utveksle elektroner med den elektroden.
PFIRE er en bredt aktuelt IR spektroskopiske teknikk for adressering elektrode-immobilisert redoks proteiner. Spesielt kan electrocatalytic reaksjoner av redoks enzymer bli undersøkt under rask omsetning forhold. Metoden PFIRE bygger på direkte elektrokjemiske kontroll av teknikken av PFE, som gir ikke direkte strukturelle informasjon, og par det til IR spektroskopi på en karbon elektrode. PFIRE tilnærmingen dermed legger kjemiske innsikt til informasjonen tilgjengelig fra elektrokjemi alene og er svært egnet til å studere redoks proteiner og enzymer som er involvert i små molekyl bindende og aktivisering. I tillegg kan PFIRE gi informasjon om potensial-avhengige strukturelle endringer i proteiner i fravær av katalytisk omsetning. Slike ikke-omsetning elektron overføre hendelser er ofte vanskelig å oppdage med ‘standard’ programmer av PFE, men utvidelsen av PFE til Fourier-forvandlet AC voltammetry har blitt brukt med stor suksess. 45 , 46
Metoden PFIRE er, i prinsippet, til studiet av noen redoks protein som kan studeres ved hjelp av PFE. Derfor, som med PFE, protein adsorpsjon er et kritisk punkt for en vellykket PFIRE-eksperiment. Vi beskriver en anvendelse av PFIRE teknikken bruker E. coli Hyd1 som en casestudie i denne protokollen. 36 , 43 men vi har også brukt PFIRE teknikken de cytoplasmatiske regulatoriske hydrogenase fra R. eutropha,44 og flavin mononucleotide adsorbert på karbon svart. 40 i alle disse tilfellene, enkle fysiske adsorpsjon uforandret høy areal karbon svart (som beskrevet i denne protokollen) gir en dekning av protein som er høy nok til å spille god kvalitet IR spectra med en høy signal-til-støy-forhold. I tilfeller der slike høye nivåer av adsorpsjon ikke kan oppnås kan det være nødvendig å endre overflaten av karbon partikler, for eksempel kovalente vedlegg protein til elektroden overflaten. 60 , 61 , 62 bruken av en glovebox for PFIRE mål er bare strengt nødvendig når studere eksempler som må håndteres anaerob. Men i praksis det ekstremt konstant og lav (< 80 ° C duggpunkt) nivåer av vanndamp som glovebox atmosfæren gir høye signal-til-støy-nivåer at utvinning av svært små absorbances. 44 i mange tilfeller en anaerob miljø, for eksempel fra en glovebox er også ønskelig for elektrokjemiske måling (integrert med PFIRE teknikken) for å unngå gjeldende på grunn av O2 reduksjon på arbeider elektroden.
IR absorbances bulk vann, eksperimentelle buffere og karbon partikler som utvalget er adsorbert bidrar betydelig til de eksperimentelle spectra og kan overlappe band av interesse, spesielt i amid I, II og III regionene den spekteret. 63 amid regionen inneholder også informasjon fra organiske arter som flavins eller nikotinamid kofaktorer, som underlag og produkter av mange oksidering og reduksjon reaksjoner. Ved NiFe hydrogenases, νCO og νCN band av det aktive området faller i en relativt klar region av spekteret og så PFIRE teknikken er godt egnet til studiet av disse enzymene. I andre tilfeller, men kan forskjellen spectra kombinert med isotopanrikning merking tilnærminger være nødvendig å isolere endringer på grunn av immobilisert protein. Lignende tilnærminger har blitt brukt til å identifisere, for eksempel protonation endres, strukturelle rearrangements og studere Michaelis-Menten komplekser bruker IR spektroskopi. 64 , 65 , 66 PFIRE er derfor, ikke begrenset til studiet av hydrogenases men kan brukes på alle redoks protein som inneholder (eller som underlag, produkter eller hemmere inneholder) grupper med diagnostiske IR-aktiv vibrasjoner; karbonmonoksid dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins,40 og formiat dehydrogenases, for eksempel.
Relaterte teknikken, SEIRA, er godt egnet til studiet av membran-assosiert proteiner i biomimetic omgivelser. 32 SEIRA er en tilpasning av IR spektroskopi som også bruker en ATR-IR-konfigurasjon, og gjør bruk av en overflate ekstrautstyr effekt som forsterker IR absorbansen molekyler ligger nær (noen nm) overflaten av ATR prisme (irsk). SEIRA er derfor utsøkt sensitive til spectral endringer som oppstår innen adsorbert protein og membran arkitekturen og er relativt fri for konkurrerende signaler fra løsemiddel og underlag/hemmere finnes i løsningen. Dette er noe i kontrast til PFIRE teknikken beskrevet her som er avhengig av en betydelig større gjennomtrenging dyp over overflaten av IRE (~ 1 µm), betyr at PFIRE er mer følsomme for underlag, produkter eller hemmere finnes i løsningen. Dette økt følsomhet for “bulk” løsemiddel kan være fordelaktig; Hvis den substrat eller produktet kan observeres direkte av IR, rapport PFIRE spectra om begge steady state kinetics varige aktiv arter og tilknyttet produktet formasjon under electrocatalysis. 69 muligheten til å observere steady state konsentrasjoner av underlaget og produktet vil være spesielt verdifull for enzymer som karbonmonoksid dehydrogenase (som gir reversibel oksidasjon av CO til CO2, en sterk IR absorber) eller formiat dehydrogenase (som gir reversibel oksidasjon av formiat CO2).
I dag er PFIRE begrenset til stabil kinetic studier av enzymet electrocatalysis på grunn av makroskopisk karbon elektrodene pleide konsentrere enzymet på overflaten av en IRE for datainnsamling i og ATR-IR geometri. I denne forbindelse er PFIRE studier av NiFe hydrogenases komplementære til arbeidet med Dyer og kolleger,49,50 som bruker lys-utløst forbigående absorpsjon IR spektroskopi for å studere sub omsetning kinetics. Arbeides å miniaturize spectroelectrochemical cellen,40 og med bruk av microelectrodes tid oppløsning på mikrosekunder bør være oppnåelig. Dette vil aktivere studie av sub omsetning kinetics for enzymer med omsetning frekvenser opp til ca 100-500 s-1og gjør studiet av både reductive og kjemiske prosesser.
Samlet er PFIRE en spektroskopiske teknikk som lar kjemisk karakterisering av electrocatalytic reaksjoner av redoks enzymer under steady state forhold. PFIRE tilnærming kan flere kjemiske og elektrokjemiske titrations utføres på samme enzym prøven, som høy areal elektrodene brukes gir en robust adsorpsjon protein og ATR-IR geometri gjør lettvinte løsning utveksling. Muligheten til å samle slik strukturinformasjon i situ under enzym funksjonen er et uvurderlig verktøy for bioelectrochemistry samfunnet.
The authors have nothing to disclose.
K.A.V. og P.A.A. ble støttet av den europeiske Research Council (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), Engineering og Physical Sciences Research Council IB katalysator prisen EP/N013514/1, og bioteknologi og biologisk vitenskap forskning Rådet (BB/L009722/1 og BB/N006321/1). R.H. ble støttet av Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, og Lincoln College, Oxford. Forfatterne bekrefter Mr. Charlie Jones, Mr. Charlie Evans og stab av mekaniske verksted (Institutt for kjemi) for hjelp i design og produksjon av spectroelectrochemical celler brukes i dette arbeidet.
Spectrometer | Agilent | 680-IR | with an external MCT detector |
ATR accessory | Pike Technologies | GladiATR | Customised for use with a 5-reflection Si IRE |
Glovebox | Glove Box Technology Ltd. | N/A | Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement |
KBr window | Crystran | Custom | To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer |
Additional optics | Agilent | N/A | Components from a PM-IRRAS accessory |
Silicon IRE | Crystal GmbH | Custom | Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle |
Potentiostat | Metrohm | Autolab PGSTAT 128N | |
Nova 10.1 | Metrohm | Software for controlling the potentiostat | |
Peristaltic pump | Williamson Manufacturing Company Ltd | QL-1000-024-300 | |
Pt wire | Surepure Chemetals | 3272 | 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter |
Carbon rod | WH Smith | 30729209 | 0.7 mm HB pencil lead |
Carbon black | Cabot Corporation | Black Pearls 2000 | |
Ultrasonic bath | Ultrawave | U100 | 35 W |
Centrifugal filter | Merck Millipore | UFC5050BK | Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5452000018 | MiniSpin |
NaCl | Sigma | 71376 | |
H2SO4 | Fisher | S/9240/PB17 | |
HNO3 | Fisher | N/2300/PB17 | |
silicone sealant | Cow Corning Toray Co., Ltd. | SE 4486 | |
Carbon paper | Toray | TGP-H-030 | |
H2 gas | BOC | ||
N2 gas | BOC | ||
OriginPro 2015 | OriginLab | Data analysis/graphing software | |
Resolutions Pro 4.0 | Varian | Software for controlling FTIR spectrometer |