قياس الالتقام حويصلة متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف
Summary
تم الكشف عن الالتقام حويصلة متشابك الخفيفة الميكروسكوب من فلورين تنصهر مع البروتين حويصلة متشابك والمجهر الإلكتروني لامتصاص حويصلة.
Abstract
خلال الالتقام، يتم استرداد حويصلات متشابك تنصهر في المحطات العصبية، مما يسمح لإعادة التدوير حويصلة ومن ثم الحفاظ على انتقال متشابك أثناء إطلاق العصبية المتكررة. الالتقام البصر في الحالات المرضية ويؤدي إلى نقصان في مهام القوة والدماغ متشابك. هنا، يمكننا وصف الطرق المستخدمة لقياس الالتقام حويصلة متشابك في المشبك هيبوكامبال الثدييات في ثقافة العصبية. نحن يرصدها الالتقام البروتين حويصلة متشابك الصمامات بروتين غشائي حويصلية متشابك، بما في ذلك سينابتوفيسين و VAMP2/سينابتوبريفين، إلى جانب لومينال حويصلية، مع فلورين، حساسة لدرجة الحموضة بروتين فلورية خضراء التي تزيد عن كثافة الأسفار كما يزيد من درجة الحموضة. خلال الرقابة، يزيد الرقم الهيدروجيني التجويف حويصلية، بينما خلال التجويف حويصلية الالتقام الأس الهيدروجيني إعادة المحمضة. وهكذا، يشير إلى زيادة كثافة fluorescence فلورين الانصهار، بينما تشير إلى انخفاض الالتقام البروتين المسمى حويصلة متشابك. بالإضافة إلى استخدام أسلوب التصوير فلورين لتسجيل الالتقام، نحن يرصدها غشاء حويصلية الالتقام بقياسات الميكروسكوب الإلكتروني (م) الفجل البيروكسيديز (HRP) امتصاص حويصلات. وأخيراً، نحن رصد تشكيل الأعصاب الطرفية الغشاء حفر في أوقات مختلفة بعد depolarization المستحثة بالبوتاسيوم عالية. يشير مسار الوقت لتشكيل حفرة الامتصاص والغشاء HRP إلى مسار الوقت الالتقام.
Introduction
أجهزة الإرسال العصبية المخزنة في حويصلات متشابك وصدر عن الرقابة. غشاء حويصلة متشابك والبروتين ثم استيعابه الالتقام، وإعادة استخدامها في الجولة القادمة للرقابة. أمر مهم للحفاظ على تجمعات حويصلة متشابك الالتقام حويصلات متشابك ويزيل حويصلات بارزة من غشاء البلازما. وقد استخدمت فلورين البروتينات الفلورية الخضراء حساسة لدرجة الحموضة، وهو مروي في الظروف الحمضية وديكوينتشيد في الأس الهيدروجيني المحايدة، لقياس الوقت الالتقام دورات في العيش الخلايا1،،من23. عادة ما ترتبط البروتين فلورين الجانب لومينال حويصلة متشابك البروتينات، مثل سينابتوفيسين أو VAMP2/سينابتوبريفين. في الراحة وهي تطفئ فلورين في التجويف pH 5.5 من حويصلات متشابك. حويصلة الانصهار لغشاء البلازما يكشف التجويف حويصلية للحل خارج الخلية حيث هو الرقم الهيدروجيني ~ 7.3، أدى إلى زيادة في الأسفار فلورين. بعد الرقابة، يتعفن fluorescence المتزايدة، نظراً الالتقام بروتينات حويصلة متشابك تليها التحمض إعادة حويصلة داخل تلك الحويصلات المستردة. على الرغم من أن يعكس الانحلال الالتقام وتحمض إعادة حويصلية، أنه يعكس الالتقام، معظمها لتحميض إعادة أسرع من الالتقام في معظم الأحوال1،4. هو وقت ثابت لإعادة التحميض s 3-4 أو أقل5،6، الذي عادة أسرع من 10 s أو أكثر مطلوب لحويصلة الالتقام4،5. إذا كانت التجارب ضرورية للتمييز بين الالتقام من إعادة التحميض، حمض تجارب التبريد باستخدام الحل (MES) حمض مورفولينيثانيسولفونيك 4 (25 مم) مع الرقم الهيدروجيني 5.5 يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان يتم استرداد البروتينات حويصلة متشابك من غشاء البلازما عن طريق الالتقام1،،من34. وبالتالي، زيادة كثافة fluorescence فلورين يعكس توازناً أكسو-والالتقام، ويعكس الانخفاض بعد تحفيز الأعصاب على وجه التحديد الالتقام.
يمكن استخدام التصوير فلورين ليس فقط لقياس الدورة الزمنية الالتقام، ولكن أيضا حجم حويصلة متشابك برك7،8، واحتمال الإفراج عن مقولة وعفوية الإفراج عن9. العديد من العوامل والبروتينات المشاركة في تنظيم الالتقام، مثل الكالسيوم وجبهة الخلاص الوطني-مرفق قابل للذوبان بروتين مستقبلات (الفخ) البروتينات، factor(BDNF) نيوروتروفيك المستمدة من الدماغ وكالسينيورين وقد حددت استخدام التصوير فلورين1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16-وعلاوة على ذلك، يمكن اكتشاف الإفراج عن العصبي في الخلايا العصبية الأولية فقط لا بل في خلايا neuroblastoma مع تيرفم17. مؤخرا، تم وضع المتغيرات فلورين، دسريد، مورانج وفتوماتو لرصد تسجيلات المتزامن لعوامل متعددة في18،المشبك واحد19. على سبيل المثال، تنصهر مع سينابتوفيسين فتوماتو ويستخدم مع مؤشر كالسيوم مشفرة جينياً (GCaMP5K) لمراقبة الانصهار حويصلة presynaptic و Ca2 + تدفق في حجرة بوستسينابتيك20. ولذلك، فلورين يعلق على البروتينات متشابك يوفر وسيلة مفيدة لتحليل العلاقة بين الالتقام والرقابة.
أم هو أسلوب آخر استخداماً في دراسة الالتقام، سبب عالية الدقة المكانية التي تظهر التغييرات ultrastructural أثناء الالتقام. اثنين من مجالات عامة هي القدرة على تصور التغييرات المرضية داخل الخلايا العصبية21 وتعقب حويصلة البروتينات22. على وجه الخصوص، مراقبة امتصاص حويصلة متشابك، انحناء غشاء المغلفة كلاثرين في منطقة بيرياكتيفي، وهياكل اندوسومال ممكن مع م3،،من2324،25 26، ،،من2728. بينما م ينطوي على التحف المحتملة، مثل التشوهات الناجمة عن مثبت، التي قد تؤثر على الالتقام، وتحليل بيانات العمالة المكثفة، أن القرار يوفر فرصة جذابة لتصور البنية الخلوية. يمكن التغلب على المشاكل المحتملة مثبت والقيد في الأزمنة م بالضغط العالي تجميد، وتوفير وسيلة سريعة وغير كيميائية لاستقرار الهياكل الدقيقة الحالية أثناء الالتقام27.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نظهر طريقتين لرصد الالتقام حويصلة متشابك. في الطريقة الأولى، يمكننا رصد فلورين تنصهر مع بروتين حويصلة متشابك في transfected الخلايا العصبية وحفزت كهربائياً في وقت لاحق. ثانيا، قمنا باستخدام التصوير م من الإقبال على برنامج الصحة الإنجابية كما فعل بوكل. نحن استخدام المحفزات المختلفة لسببين….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور تشو يونغ لينغ لتوفير بنية سينابتوفيسين-pHluorin2x، والدكتور جيمس روثمان هاء لتقديم VAMP2-فلورين. ونشكر الدكتورة سوزان تشنغ وفيرجينيا كروكر NINDS الميكروسكوب الإلكتروني مرفق للدعم التقني والمساعدة. هذا العمل كان يدعمها المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية داخلية برنامج البحوث في الولايات المتحدة الأمريكية، ومنحة من KRIBB مبادرة برنامج البحوث (الكورية الطبية الحيوية عالم برنامج زمالة)، المعهد الكوري لأبحاث العلوم الحيوية والتكنولوجيا الحيوية، وجمهورية كوريا.
Materials
| Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
| neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
| Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
| Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
| pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
| Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
| stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
| lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
| AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
| EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
| Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
| imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
| poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
| Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
| Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
| TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
| CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
| Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
References
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
- Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses. J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).
- Wu, X. -. S. S., Lee, S. H., et al. Actin Is Crucial for All Kinetically Distinguishable Forms of Endocytosis at Synapses. Neuron. 92 (5), 1020-1035 (2016).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
- Atluri, P. P., Ryan, T. A. The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals. J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).
- Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses. Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).
- Moulder, K. L., Mennerick, S. Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons. J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).
- Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).
- Morris, R. G. Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas. Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses. Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).
- Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse. J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).
- Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis. Science. 316 (5824), 570-574 (2007).
- Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. G. Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation, exocytosis, and endocytosis at a central nerve terminal. J Neurosci. 35 (11), 4676-4682 (2015).
- Wu, X. S., Zhang, Z., Zhao, W. D., Wang, D., Luo, F., Wu, L. G. Calcineurin is universally involved in vesicle endocytosis at neuronal and nonneuronal secretory cells. Cell Rep. 7 (4), 982-988 (2014).
- Zhang, Z., Wang, D., et al. The SNARE proteins SNAP25 and synaptobrevin are involved in endocytosis at hippocampal synapses. J Neurosci. 33 (21), 9169-9175 (2013).
- Wu, L. -. G. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).
- Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis. J Vis Exp. (95), e52267 (2015).
- Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
- Leitz, J., Kavalali, E. T. Fast retrieval and autonomous regulation of single spontaneously recycling synaptic vesicles. Elife. 3, e03658 (2014).
- Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J Vis Exp. (112), e54060 (2016).
- Schikorski, T. Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope. High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).
- Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses. Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).
- Wu, Y., O’Toole, E. T., et al. A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis. eLife. 2014 (3), e01621 (2014).
- Heuser, J. E., Reese, T. S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).
- Watanabe, S., Rost, B. R., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
- Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
- Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function. Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).
- Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging. Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., García-Cánovas, F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).
- Deák, F., Schoch, S., et al. Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).
- Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
- Wienisch, M., Klingauf, J. Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical. Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).
- Fernández-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
- Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins. Nat Commun. 6, 8392 (2015).
- Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin. J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Wisse, E., Braet, F., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Søndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions. J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).
