JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

PIP-on-a-chip: En etikettfri studie av protein-fosfinositid-interaktioner

Published: July 27, 2017
doi:
10.3791/55869
, , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Biology,The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry,The Pennsylvania State University

Summary

Här presenterar vi ett stödjande lipid-dubbelskikt i samband med en mikrofluidisk plattform för att studera interaktioner med protein-fosfinositid med en etikettfri metod baserad på pH-modulering.

Abstract

Många cellulära proteiner interagerar med membranytor för att påverka väsentliga cellulära processer. Dessa interaktioner kan riktas mot en specifik lipidkomponent i ett membran, såsom i fallet med fosfoinositider (PIP), för att säkerställa specifik subcellulär lokalisering och / eller aktivering. PIP och cellulära PIP-bindande domäner har studerats i stor utsträckning för att bättre förstå deras roll i cellfysiologi. Vi tillämpade en pH-moduleringsanalys på stödda lipid-bilayers (SLB) som ett verktyg för att studera protein-PIP-interaktioner. I dessa studier används pH-känslig orto- sulforhodamin B-konjugerad fosfatidyletanolamin för att detektera protein-PIP-interaktioner. Vid bindning av ett protein till en PIP-innehållande membranyta moduleras gränsspotentialen ( dvs förändring i lokalt pH), förskjutning av sondens protoneringstillstånd. En fallstudie av den framgångsrika användningen av pH-moduleringsanalysen presenteras med användning av fosfolipas C delta1 Pleckstri Homologi (PLC-δ1 PH) domän och fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PI (4,5) P 2) interaktion som ett exempel. Den uppenbara dissociationskonstanten ( Kd, app ) för denna interaktion var 0,39 ± 0,05 pM, liknande Kd, appvärden erhållna av andra. Såsom tidigare observerats, är PLC-δ1 PH-domänen PI (4,5) P 2 specifik, visar svagare bindning mot fosfatidylinositol 4-fosfat, och ingen bindning till rena fosfatidylkolin SLBs. PIP-on-a-chip-analysen är fördelaktig jämfört med traditionella PIP-bindningsanalyser, inkluderande men inte begränsat till lågprovvolym och inga krav på ligand / receptormärkning, förmågan att testa membraninteraktioner med hög och låg affinitet med både små och Stora molekyler och förbättrat signal-brusförhållande. Följaktligen kommer användningen av PIP-on-a-chip-tillvägagångssättet att underlätta belysningen av mekanismer för ett brett spektrum av membraninteraktioner. Dessutom kan denna metod eventuellt vara digSed i identifierande terapier som modulerar proteins förmåga att interagera med membran.

Introduction

Myriad interaktioner och biokemiska processer sker på tvådimensionellt flytande membranytor. Membran-slutna organeller i eukaryota celler är unika inte bara i biokemiska processer och deras associerade proteom utan även i deras lipidsammansättning. En exceptionell klass av fosfolipider är fosfinositider (PIP). Trots att de bara omfattar 1% av cellulär lipidom spelar de en avgörande roll i signaltransduktion, autofag och membranhandel, bland annat 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamisk fosforylering av inositolhuvudgruppen med cellulära PIP-kinaser ger upphov till sju PIP-huvudgrupper som är mono-, bis- eller trisfosforylerade 5 . Dessutom definierar PIP den membranens subcellulära identitet och tjänar som specialiserade membran dockningsställen för proteiner / enzymer innehållande en eller flera fosforinoserItidbindande domäner, till exempel Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) och epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . En av de bäst studerade PIP-bindande domäner är fosfolipas C (PLC) -δ1 PH-domänen som specifikt interagerar med fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) inom ett högt nanomolar-låg mikromolära området affinitet 8 , 9 , 10 , 11 .

En rad kvalitativa och kvantitativa in vitro- metoder har utvecklats och använts för att studera mekanismen, termodynamiken och specificiteten av dessa interaktioner. Bland de vanligast använda PIP-bindningsanalyserna är ytplasmonresonans (SPR), isotermisk kalorimetri (ITC), NMR-spektroskopi, NMR-analys, liposomflotation / sedimentationsanalys och lipid-blottar (Fett-Blots / PIP-remsor)12 , 13 . Trots att dessa används i stor utsträckning har de alla många nackdelar. Exempelvis kräver SPR, ITC och NMR stora mängder av prov, dyr instrumentation och / eller utbildad personal 12 , 13 . Vissa analysformat såsom antikroppsbaserade lipidblottar utnyttjar vattenlösliga former av PIP och presenterar dem på ett icke-fysiologiskt sätt 12 , 14 , 15 , 16 . Dessutom kan lipidblots inte kvantifieras på ett tillförlitligt sätt och de har ofta resulterat i falska positiva / negativa observationer 12 , 17 , 18 . För att övervinna dessa utmaningar och förbättra den nuvarande verktygssatsen upprättades en ny etikettfri metod baserad på ett stödjande lipid-dubbelskikt (SLB) i samband med am Mikrofluidisk plattform, som framgångsrikt användes vid studien av protein-PIP-interaktioner ( Figur 1 ) 19 .

Strategin som används för att detektera protein-PIP-interaktioner baseras på pH-moduleringsavkänning. Detta involverar ett pH-känsligt färgämne som har orto- sulforhodamin B ( o SRB) direkt konjugerad till fosfatidyletanolamin lipidhuvudgrupp 20 . O SRB-POPE-sond (Figur 2A) är mycket fluorescerande vid lågt pH och släcktes vid högt pH med ett pKa omkring 6,7 inom 7,5 mol-% PI (4,5) P2-innehållande SLBs (figur 5B). PLC-δ1 PH-domänen har använts i stor utsträckning för att validera protein-PIP-bindande metoder beroende på dess höga specificitet mot PI (4,5) P2 (figur 5A) 21, 22,"> 23, 24, 25 .Hence, resone vi att PLC-δ1 PH-domänen kan användas för att testa dess bindning till PI (4,5) P2 genom PIP-on-a-chip-analys. PH-domänen konstrukt Den används i denna studie har en positiv nettoladdning (pl 8,4), och attraherar därmed OH -. joner (Figur 5C) vid bindning till PI (4,5) P 2 -innehållande SLBs, ger PH-domänen OH – joner till den membranytan, som i sin tur modulerar den interfacial potential och förskjuter protonetillstånd o SRB-POPE (figur 5C) 26. som en funktion av PH-domän koncentrationen, är fluorescensen släckes (figur 6A). Slutligen, är den normaliserade data som passa till en bindande isotermen för att bestämma affiniteten hos PH-domänen-PI (4,5) P 2 interaktion (figur 6B, 6C). </ P>

I denna studie tillhandahålls ett detaljerat protokoll för att utföra proteinbindning till PIP-innehållande SLB i en mikrofluidisk plattform. Detta protokoll tar läsaren från att montera den mikrofluidiska enheten och vesikelpreparatet till SLB-bildning och proteinbindning. Dessutom till riktningar för analys av data extrahera affinitets information för PLC-δ1 PH-domänen-PI (4,5) P 2 interaktion tillhandahålls.

Protocol

1. Rengör glasskyddet Torka 7x rengöringslösning (se materialbord ) 7-faldigt med avjoniserat vatten i en 100 mm djup borosilikatglasfat med en platt botten och värm upp till 95 ° C på en platt platt platta i 20 minuter eller tills den muliga lösningen blir klar . OBS: Lösningen blir varm, var försiktig för att undvika kroppsskador. 7x rengöringslösningen är en proprietär blandning av hexasodium [oxido- [oxido (fosfonatooxi) fosforyl] oxifosforyl] fosfat, 2- (2-butoxietox…

Representative Results

Vi använt pH module analys för att studera PLC-δ1 PH-domänen-PI (4,5) P 2 interaktion inom en PIP-on-a-chip mikroanordning (figur 1). Genom ett detaljerat protokoll visade vi hur man förbereder och monterar mikrofluidiska komponentdelar, tillverkar små unilamellära vesiklar (SUV) ( Figur 2 ), bildar SLB i en enhet ( Figur 3 ) och testad proteinbindning till PIP-innehållande SLB. E…

Discussion

Varje PIP-variant, om än i låga koncentrationer, är närvarande på den cytosoliska ytan av specifika organeller där de bidrar till upprättandet av en unik fysisk sammansättning och funktionell specificitet hos det organella membranet 1 . En av de viktigaste användningarna av PIP är som en specifik dockningsplattform för de många proteiner som kräver specifik subcellulär lokalisering och / eller aktivering 6 , 7 . På grund av…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DS och CEC stöddes delvis, genom bidrag AI053531 (NIAID, NIH); SS och PSC stöddes av bidrag N00014-14-1-0792 (ONR).

Materials

Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate  Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Other
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796 (2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34 (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O’Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39 (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what’s in it for biomedical applications?. Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1 (2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).

Tags

Keywords: Protein-phosphoinositide InteractionsLabel-freeMembrane InteractionsPIP-on-a-chip AssayPDMSPhosphatidylcholinePhosphatidylinositol 45-bisphosphatePH-sensitive Fluorescent ProbeLipid VesiclesLabel-free MonitoringBiologically RelevantTherapeutic TargetsMembrane Proteins
check_url/55869?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image