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Bioengineering

PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

Published: July 27, 2017
doi:
10.3791/55869
, , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Biology,The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry,The Pennsylvania State University

Summary

Aqui, apresentamos uma bicamada lipídica suportada no contexto de uma plataforma microfluídica para estudar as interações proteína-fosfoinositide usando um método livre de rótulas baseado na modulação do pH.

Abstract

Numerosas proteínas celulares interagem com superfícies de membrana para afetar processos celulares essenciais. Essas interações podem ser direcionadas para um componente lipídico específico dentro de uma membrana, como no caso de fosfoinositidos (PIPs), para garantir a localização e / ou ativação subcelular específica. PIPs e domínios de ligação celular PIP foram estudados extensivamente para entender melhor seu papel na fisiologia celular. Aplicamos um teste de modulação de pH em bicamadas lipídicas (SLBs) suportadas como uma ferramenta para estudar interações proteína-PIP. Nestes estudos, a fosfatidiletanolamina conjugada orto- Sulforododina B, utilizada para o pH, é utilizada para detectar interações proteína-PIP. Após a ligação de uma proteína a uma superfície de membrana contendo PIP, o potencial interfacial é modulado ( isto é, mudança no pH local), deslocando o estado de protonação da sonda. Um estudo de caso do uso bem sucedido do ensaio de modulação de pH é apresentado usando fosfolipase C delta1 PleckstrNo domínio da Homologia (PLC-δ1 PH) e da fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PI (4,5) P 2 ) como exemplo. A constante de dissociação aparente ( K d, app ) para essa interação foi de 0,39 ± 0,05 μM, semelhante a K d, valores de aplicativos obtidos por outros. Como observado anteriormente, o domínio PH de PLC-δ1 é PI (4,5) P 2 específico, mostra fraca ligação no sentido de fosfatidilinositol-4 fosfato, e nenhuma ligação a SLBS fosfatidilcolina pura. O ensaio PIP-on-a-chip é vantajoso em relação aos ensaios tradicionais de ligação a PIP, incluindo, mas não limitado a, baixo volume de amostra e nenhum requerimento de marcação de ligando / receptor, a capacidade de testar interações de membrana de alta e baixa afinidade com pequenas e pequenas Grandes moléculas e uma relação sinal / ruído melhorada. Consequentemente, o uso da abordagem PIP-on-a-chip facilitará a elucidação de mecanismos de uma ampla gama de interações de membrana. Além disso, este método poderia ser potencialmente vocêNa identificação de terapias que modulam a capacidade da proteína para interagir com as membranas.

Introduction

Inúmeras interacções e processos bioquímicos ocorrem em superfícies de membranas fluidas de duas dimensões. Os organelos fechados em membrana em células eucarióticas são únicos, não apenas nos processos bioquímicos e seu proteoma associado, mas também na sua composição lipídica. Uma classe excepcional de fosfolípidos é fosfoinositides (PIPs). Embora constituam apenas 1% do lipidoma celular, eles desempenham um papel crucial na transdução de sinal, autofagia e tráfico de membrana, entre outros 1 , 2 , 3 , 4 . A fosforilação dinâmica do grupo de cabeça de inositol pelas quinases PIP celulares dá origem a sete grupos principais PIP que são mono-, bis- ou trisfosforilados 5 . Além disso, os PIPs definem a identidade subcelular das membranas e servem como locais de encaixe de membrana especializados para proteínas / enzimas contendo um ou mais fosfoinosDomínios de vinculação, por exemplo, Pleopstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) e epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . Um dos domínios de ligação ao PIP mais bem estudados é o da fosfolipase C (PLC) domínio PH -δ1 que interage especificamente com fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) dentro de uma gama micromolar nanomolar de baixa afinidade elevada 8 , 9, 10, 11.

Uma variedade de métodos in vitro qualitativos e quantitativos foram desenvolvidos e utilizados para estudar o mecanismo, termodinâmica e especificidade dessas interações. Entre os ensaios de ligação a PIP mais utilizados são a ressonância de plasmão de superfície (SPR), a calorimetria isotérmica (ITC), a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), o ensaio de flotação / sedimentação de lipossomas e transferências de lipidos (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Embora estes sejam amplamente utilizados, todos eles têm muitas desvantagens. Por exemplo, SPR, ITC e RMN requerem grandes quantidades de amostras, instrumentação cara e / ou pessoal treinado 12 , 13 . Alguns formatos de ensaio, tais como tampões lipídicos baseados em anticorpos, utilizam formas solúveis em água de PIPs e os apresentam de maneira não fisiológica 12 , 14 , 15 , 16 . Além disso, as transferências de lípidos não podem ser quantificadas de forma confiável e muitas vezes resultaram em observações falsas positivas / negativas 12 , 17 , 18 . Para superar esses desafios e melhorar o conjunto de ferramentas atual, um novo método livre de etiqueta foi estabelecido com base em uma bicamada lipídica suportada (SLB) no contexto de am Plataforma icrofluidica, que foi aplicada com sucesso no estudo das interações proteína-PIP ( Figura 1 ) 19 .

A estratégia empregada para detectar interações proteína-PIP é baseada na detecção de modulação de pH. Isto envolve um corante sensível ao pH que tem orto- Sifforodamina B ( o SRB) diretamente conjugado com o grupo de cabeça lipídica de fosfatidiletanolamina 20 . A sonda o SRB-PAPA (Figura 2A) é altamente fluorescente a um pH baixo e extinguiu-se a pH elevado com um pKa dentro de cerca de 6,7 7,5 mol% de PI (4,5) P 2 SLBS molecular contendo (Figura 5B). O domínio PLC-δ1 PH tem sido amplamente utilizado para validar as metodologias de ligação à proteína-PIP devido à sua alta especificidade em relação a PI (4,5) P 2 ( Figura 5A ) 21 , 22 ,"23 , 24 , 25. Assim, argumentamos que o domínio PH do PLC-δ1 pode ser usado para testar sua ligação ao PI (4,5) P 2 através do ensaio PIP-on-a-chip. A construção do domínio PH utilizado no presente estudo tem uma carga global positiva (pI 8,4), e, assim, atrai OH -. iões (Figura 5C) após ligação a PI (4,5) P 2 SLBS molecular contendo, o domínio PH traz as OH – iões para o superfície da membrana, que por sua vez modula o potencial interfacial e muda o estado de protonação do SRB-PAPA (Figura 5C) 26. Como uma função da concentração de domínio PH, a fluorescência é extinta (figura 6A). Finalmente, os dados normalizados é ajustar a uma isotérmica de ligação para determinar a afinidade do domínio PH-PI (4,5) P 2 interacção (Figura 6B, 6C). </ P>

Neste estudo, um protocolo detalhado é fornecido para realizar a ligação de proteínas aos SLBs contendo PIP dentro de uma plataforma microfluídica. Este protocolo leva o leitor a montar o dispositivo microfluídico e a preparação da vesícula para a formação de SLB e ligação de proteínas. Além disso, instruções para a análise de dados para extrair a informação de afinidade para o domínio PI-PLC-δ1 PH (4,5) P 2 interacção são fornecidos.

Protocol

1. Limpando as lâminas de vidro Diluir a solução de limpeza 7x (ver Tabela de materiais ) 7 vezes com água desionizada em um prato de vidro de borosilicato de 100 mm de profundidade com um fundo plano e aquecê-lo até 95 ° C em uma placa quente nivelada durante 20 min ou até a solução turva ficar clara . NOTA: A solução será quente, tenha cuidado para evitar lesões corporais. A Solução de Limpeza 7x é uma mistura proprietária de fosfato de hexasódio [oxido (fosfonatoo…

Representative Results

Utilizou-se o ensaio de modulação pH para estudar o PLC-δ1 PH domínio de PI (4,5) P 2 interacção dentro de um microdispositivo de PIP-on-a-chip (Figura 1). Através de um protocolo detalhado, demonstramos como preparar e montar componentes de dispositivos microfluídicos, fazer pequenas vesículas unilamelares (SUVs) ( Figura 2 ), formar SLBs dentro de um dispositivo ( Figura 3 ) e …

Discussion

Cada variante PIP, embora com baixas concentrações, está presente na superfície citosólica de organelas específicas, onde contribuem para o estabelecimento de uma composição física única e especificidade funcional da membrana organelar 1 . Um dos usos mais importantes dos PIPs é como uma plataforma de encaixe específica para a multiplicidade de proteínas que requerem localização e / ou ativação subcelular específica 6 , 7</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DS e CEC foram apoiados, em parte, pela concessão AI053531 (NIAID, NIH); SS e PSC foram apoiados pela concessão N00014-14-1-0792 (ONR).

Materials

Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate  Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Other
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider
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Keywords: Protein-phosphoinositide InteractionsLabel-freeMembrane InteractionsPIP-on-a-chip AssayPDMSPhosphatidylcholinePhosphatidylinositol 45-bisphosphatePH-sensitive Fluorescent ProbeLipid VesiclesLabel-free MonitoringBiologically RelevantTherapeutic TargetsMembrane Proteins
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Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).
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