Mönstring bioaktiva proteiner eller peptider på Hydrogel med fotokemi för biologiska tillämpningar
Summary
Den här metoden använder vi fotopolymerisation och klicka på kemi tekniker för att skapa protein eller peptid mönster på ytan av polyetylenglykol (PEG) hydrogels, som tillhandahåller orörlig bioaktiva signaler för studiet av cellulära svar in vitro- .
Abstract
Det finns många biologiska stimuli som kan påverka celldifferentiering beteende och stamceller. De allmänna cell kultur metoder förlitar sig på lösliga faktorer inom mediet till kontroll cell beteende. Dock efterlikna inte lösliga tillägg vissa signalering motiv, såsom matrix-bundna tillväxtfaktorer, cell-cell signalering och rumsliga biokemiska signaler, som är gemensam påverkan på celler. Dessutom spelar biofysiska egenskaper för matrisen, såsom substrat stelhet, viktiga roller i cell öde, som inte är lätt manipuleras med hjälp av konventionella cell odlingsskålar praxis. Den här metoden beskriver vi ett enkelt protokoll för att ge mönstrade bioaktiva proteiner på syntetiska polyetylenglykol (PEG) hydrogels använder fotokemi. Denna plattform möjliggör oberoende kontroll av substrat stelhet och rumsliga biokemiska signaler. Dessa hydrogels kan uppnå ett stort utbud av fysiologiskt relevanta stelhet värden. Dessutom dessa hydrogels kan vara photopatterned med bioaktiva peptider eller proteiner via thiol-ene Klicka kemi reaktioner. Dessa metoder har optimerats för att behålla proteinfunktion efter ytan immobilisering. Detta är en mångsidig protokoll som kan användas till protein eller peptid av intresse att skapa en mängd olika mönster. Slutligen kan celler seedade på ytor av dessa bioaktiva hydrogels övervakas över tid eftersom de svarar rumsligt specifika signaler.
Introduction
I området i närheten finns det många stimuli som påverkar cellen beteende. I allmänhet typiska cell odlingsskålar tekniker förlitar sig på lösliga faktorer att framkalla cellulära svar; dock finns det begränsningar för detta synsätt. Dessa metoder är inte korrekt Visa alla signalering motiv vanligt förekommande invivo. Sådana signalering mekanismer inkluderar beslagtagna tillväxtfaktorer, cell-cell signalering och rumsligt-specifika biokemiska signaler. Dessutom substrat stelhet kan spela en viktig roll i beteende och stamceller celldifferentiering och är inte lätt manipuleras med hjälp av gemensamma cell odlingsskålar praxis1,2. Biomaterial metoder erbjuder en ny plattform för att börja utforska dessa signalering mekanismer. Hydrogeler är särskilt utmärkta kandidater för tuning substrat stelhet3,4, immobilisera proteiner och peptider5,6, och skapa rumsligt särskilda mönster7, 8.
Hydrogeler används ofta som ställningar i vävnadsteknik på grund av deras biofysiska och biokemiska likheter med extracellulär matrix (ECM)9,10. Naturliga polymerer är gemensamma val för ställningar, eftersom de är biokompatibelt och finns i många vävnader i kroppen. Begränsning av använda naturliga polymerer som substrat är att de saknar lättmanipulerade kemiska beståndsdelarna för bioconjugation. Å andra är syntetiska hydrogels, som sådan som PEG, utmärkta plattformar för riktade kemier11,12. Dessutom PEG hydrogels framkalla inte en cellulär reaktion och används därför som inert stamnät för att skapa bioaktiva ställningar.
Skapa bioaktiva hydrogels, både fotopolymerisation och thiol-ene Klicka på kemi reaktioner är anställda. Dessa photoreactions kräver en photoinitiator och en UV-ljuskälla. När photoinitiators införs för UV-ljus, bryta obligationer till formuläret radikaler. Avhandlingar radikaler är nödvändiga för att inleda reaktionen men kan negativt påverka protein bioaktivitet12,13. Därför är det avgörande att optimera photoinitiator och UV exponering gånger att upprätthålla protein bioaktivitet.
I denna metod syntetiseras hydrogels genom akrylat-akrylat kedja tillväxt fotopolymerisation. PEG-diacrylate (PEGDA) monomerer reagerar med varandra för att bilda förgrenad polymer networks ansvarar för strukturera av hydrogel. Koncentrationen av PEGDA monomerer inom föregångare gellösningen styr substrat styvheten. På grund av lilla porstorlek av hydrogel, ECM proteiner såsom Fibronektin kan enkelt införlivas inom hydrogel i syfte att cell fastsättning. Slutligen, dessa hydrogels kan vara yta-mönstrad med bioaktiva peptider eller proteiner via thiol-ene Klicka på kemi reaktioner. Här, reagerar oreagerad gratis akrylater inom hydrogel systemet med gratis tioler ligger på protein eller peptid när den utsätts för UV-ljus. Efter de proteiner eller peptider är orörlig på hydrogel ytan, kan hydrogel lagras vid 4 ° C i flera veckor utan att förlora bioaktivitet. Detta erbjuder bekvämlighet, flexibel experimentell planering och möjligheten för samarbete mellan labs. Sammantaget ger denna plattform biomekaniska och rumsliga biokemiska kontroll, oberoende av varandra, för möjlighet att påverka cellulära beteende.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll ger en metod för att skapa bioaktiva protein mönster för biologiska applikationer. I området i närheten finns det flera ändringar som kan göras för att anpassa detta protokoll för olika experiment. Första varierar cellen anslutningskrav för olika celltyper. Om dålig cell fastsättning gelerna observeras initialt, rekommenderas öka koncentrationen av proteinet ECM inom föregångare lösningen. Andra ECM proteiner kan användas istället för Fibronektin, inklusive olika typer av kollagen, lam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes främst av bidrag från den amerikanska hjärtat Association vetenskapsman utveckling Grant (12SDG12050083 att G.D.), National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245 att G.D.) och National Science Foundation (Fortsättningssatsningen-1263455 och CBET-1350240 att G.D.).
Materials
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin – Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
References
- Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
- Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
- Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
- Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
- Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
- Truat’s Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/…/MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017)
- Ellman’s Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017)
- Desalting Columns. GE Life Sciences Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017)
