オートファジー研究でタンパク質間相互作用の研究
Summary
ここでは、2 つの抗体を用いたタンパク質間相互作用研究手法を提示: 蛍光抗体法と免役沈降法。これらのテクニックは、蛋白質、細胞のシグナル伝達経路の新規成分の探索と理解蛋白質の原動力の間の物理的な相互作用を研究するために適しています。
Abstract
蛋白質蛋白質の相互作用は、タンパク質ダイナミクスと識別経路コンポーネントについて細胞シグナル伝達カスケードにとって重要です。細胞活動の大半は、タンパク質間の物理的な相互作用を必要とします。分析し、これらの相互作用の地図、バイオインフォマティクスのツールと同様に、各種の実験技術が開発されました。オートファジーとは異なるストレス、栄養不足、化学物質、低酸素などに対処するため細胞をできるメカニズムをリサイクル携帯。オートファジー関連シグナル イベントを理解するために、オートファジーにおける膜タンパク質を調節する新規因子を発見するため、蛋白質蛋白質の相互作用の画面を行った。これらの審査結果の検証には、蛍光抗体法や免疫沈降の技術の使用が必要です。このシステムで我々 を発見した特定オートファジー関連の蛋白質蛋白質の相互作用は、Neuro2A でテストされた (N2A) や HEK293T 細胞。この可視化モデル実験紙の使用技術的な手順の詳細を説明します。
Introduction
Macroautophagy (オートファジー、ここ) 一括細胞質、蛋白質およびオートファジー小胞と呼ばれる二重膜の小胞の細胞器官の隔離によって特徴付けられる細胞ストレス メカニズムです。二重膜の外側の層の融合、オートファジー小胞で、貨物がリソソームに配信され、1をそこに低下します。オートファジーは、すべての細胞型のタンパク質分解や細胞小器官 (例えばミトコンドリア) 売り上げ高などの恒常性の機能を実行するすべての有機体に低基底のレベルで発生します。飢餓などの細胞ストレスにつながる条件下でオートファジー誘導では急速を使用することができ、エネルギー レベルと基礎代謝1,2,3を維持する細胞。
酵母からクローンされた約 30 のオートファジー遺伝子とタンパク質製品小胞核拡大、後期エンドソーム/リソソームと貨物劣化する小胞の融合を含むオートファジーのプロセスのさまざまな段階の役割を果たすことが示されました。4,5します。 これらの遺伝子の大半の識別され、様々 な生物の研究の細胞機能6の保全を確認しました。過去 10 年間の研究をいくつかを示しオートファジー関連タンパク質複合体とタンパク質間相互作用が存在し、複雑なかつ制御された方法でのオートファジー経路を支配します。交差点やバックアップ、フィードバック、フィード フォワード メカニズムが存在でき、(小胞分泌、リソソーム器官、エンドソーム選別と輸送7等)などの他の関連イベントでオートファジーを調整するセル、餌としてオートファジー タンパク質 ATG5 を使用して公平な酵母 2 ハイブリッド スクリーンで (ATG5 は飢餓の LC3 脂質を仲介する E2 のような抱合システムにかかわる蛋白質をキー オートファジー誘導されるオートファジー) 受容体の活性化がわかりましたがC キナーゼ 1 (RACK1;GNB2L1) 強い相互作用と新しいオートファジー コンポーネント8。重要なは、画面は、ATG5 RACK1 相互作用が古典的なオートファジー誘導 (すなわち飢餓や mTOR 阻害) によるオートファジー誘導に不可欠ななかったことを示した。
蛍光ベースの方法は、蛋白質蛋白質の相互作用を監視する一般的使用されます。これらのテクニックは主に抗体ベースし、の相互作用を視覚化および細胞局在化を確認するのに役立ちます。この手法では、蛍光タグに固有に活用された抗体興味の蛋白質は通常特定の染色に使用されます。各蛋白質は異なる蛍光色素と結合した抗体と分類する場合があります。蛋白質特定の抗体を使用して、画像をマージするときに信号の重複は共焦点顕微鏡の下で蛋白質の共局在をことを示します。技術は、細胞や組織もに適用されます。蛍光免疫測定法相互作用ダイナミクスについての手がかりを提供し、サイズと異なる条件の9の下で細胞の形態の一般的な変化を追跡しながらタンパク質複合体の分布を特定します。免疫沈降は相互作用の解析ができる別の一般的に使用される抗体を用いたテクニックの間、蛋白質10を与えられました。この手法を使用すると、興味の蛋白質は細胞からの分離、または興味の蛋白質との接触は、複合体の蛋白質の沈殿物の結果として、特定の抗体を用いた組織を抽出します。Co-免疫沈降、タンパク質とその共同のインターアクターが検出された場所だけではなく 2 つの蛋白質間の相互作用を明らかにするが、11さまざまな状況下での相互作用の強さを測定することができます。
このプロトコルで詳細を確認し、ATG5 RACK1 と RACK1 LC3 の相互作用を特徴付けるに使用された主要なテクニックについて説明します。蛍光抗体法と免役沈降法テクニックを重要なステップとオートファジーの研究だけでなく、トラブルシューティングのための落とし穴の重点にフォーカスがあります。
Protocol
Representative Results
Discussion
免疫沈降法と蛍光抗体法の技術は蛋白質蛋白質の相互作用の研究のために重要です。これら 2 つの手法が一般的に使用されると定評が、これらの技術の使用中の実験の質を定義するいくつかの基準を考慮されなければなりません。
これらのテストで使用される最初、一次抗体は興味の蛋白質に特定する必要があります。、そのためには、shRNA ノックダウンまたはノック?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、科学および技術研究議会のトルコ (TUBITAK) 1001 グラント 107T153、サバンチ大学によって支えられました。セバスチャンと所蔵は、TUBITAK BIDEB 2211 奨学金博士の研究によってサポートされます。
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
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