Studie av Protein-protein interaktioner i autofagi forskning
Summary
Presenteras här är två antikroppsbaserade protein-protein interaktioner forskningstekniker: immunofluorescens och immunoprecipitation. Dessa tekniker är lämpliga för att studera fysiska interaktioner mellan proteiner för upptäckten av nya komponenter av cellulära signalvägar och förståelse protein dynamics.
Abstract
Protein-protein interaktioner är viktiga för förståelsen cellulär signalering kaskader och identifierande roman väg komponenter och protein dynamics. Majoriteten av cellulära aktiviteter kräver fysiska interaktioner mellan proteiner. För att analysera och kartlägga dessa interaktioner, utvecklades olika experimentella tekniker samt bioinformatiska verktyg. Autofagi är en cellulär återvinning mekanism som gör att cellerna att klara olika stressorer, inklusive näringsämnen deprivation, kemikalier och hypoxi. För att bättre förstå autofagi-relaterade signalering händelser och upptäck nya faktorer som reglerar proteinkomplex i autofagi, utfört vi protein-protein interaktioner skärmar. Validering av dessa screening resultat kräver användning av immunofluorescens och immunoprecipitation tekniker. I detta system, specifika autofagi-relaterade protein-protein interaktioner som vi upptäckte testades i Neuro2A (N2A) och HEK293T cellinjer. Detaljer för tekniska metoderna förklaras i detta visualiseras experiment papper.
Introduction
Macroautophagy (autofagi, häri) är en cellulär stress mekanism som kännetecknas av beslagtagande av bulk cytoplasman, proteiner och organeller i dubbla membran blåsor kallas autophagic blåsor. Genom fusion av det yttre lagret av den dubbla membranen, autophagic blåsor och deras last levereras till lysosomer och förstörd däri1. Autofagi uppstår vid låga basala nivåer i alla celltyper och i alla organismer, utför homeostatiska funktioner såsom proteinnedbrytning och organell (t.ex., mitokondrierna) omsättning. Under förhållanden som leder till cellulär stress, såsom hungersnöd, autofagi är snabbt uppreglerad och tillåter cellen att upprätthålla energinivåer och grundläggande metabolism1,2,3.
Omkring 30 autofagi gener har blivit klonad från jästen och deras proteinprodukter visades att spela en roll i olika stadier av autophagic processen, inklusive vesikler nukleation, expansion, vesikler fusion till sena endosome/lysosomen, och Last nedbrytning 4 , 5. Orthologs av majoriteten av dessa gener har identifierats och studier i olika organismer bekräftat bevarandet av deras cellulära funktioner6. Studier under det senaste decenniet visade att flera autofagi-relaterade proteinkomplex och protein-protein interaktioner finns och att de reglerar autofagi vägar i en intrikat och kontrollerat sätt. Korsningar, säkerhetskopior, feedback och återkoppling mekanismer existerar, och de tillåter cellen att samordna autofagi med andra relaterade händelser (såsom vesikulär sekretion, Lysosomen biogenes, endosomal sortering och transport7, etc.) I en opartisk jäst-två hybrid skärm använder proteinet autofagi ATG5 som ett bete, (ATG5 är en nyckel autofagi protein som deltar i E2-liknande konjugera systemet som medierar LC3 lipidation i svält inducerad autofagi), vi har identifierat receptorn aktiveras C-Kinas 1 (RACK1; GNB2L1) som en stark datadestination och en roman autofagi komponent8. Ännu viktigare, visade skärmen att ATG5-RACK1 interaktionen var oumbärlig för autofagi induktion av klassiskt autofagi inducerare (dvs, svält och mTOR-hämning).
Immunofluorescens-baserade metoder är vanligen används för att övervaka protein-protein interaktioner. Dessa tekniker är främst antikroppsbaserade, och hjälp att visualisera interaktioner och bekräfta cellulära lokaliseringar. I denna teknik, fluorescerande tagga konjugerade antikroppar som är specifika för proteiner av intresse är vanligen används för specifik färgning. Varje protein kan märkas med antikroppar kopplat till olika fluorescerande färgämnen. En överlappning i signalen när bilder sammanfogas med protein-specifika antikroppar, och anger samtidig localizationen av proteiner under konfokalmikroskopi. Tekniken är tillämplig även vävnader eller. Immunofluorescens tekniker ge ledtrådar om interaktion dynamics, och hjälpa till att identifiera storleken och fördelningen av proteinkomplex, medan spåra generella förändringar i cellulära morfologi under olika förhållanden9. Immunoprecipitation är en annan vanligt förekommande antikroppsbaserade teknik som möjliggör analys av interaktioner mellan ges proteiner10. Med denna teknik, proteiner av intresse är isolerade från celler eller vävnad extrakt med specifika antikroppar, vilket resulterar i utfällning av proteiner som är i en komplex eller i kontakt med ett protein av intresse. Co-immunoprecipitation, där proteinet och dess samtidig datadestination upptäcks, avslöjar inte bara samverkan mellan de två proteinerna, men kan mäta sin styrka av interaktion under olika omständigheter11.
Det här protokollet beskriver i detalj viktiga tekniker som användes för att bekräfta och karakterisera ATG5-RACK1 och RACK1-LC3 interaktion. Fokus ligger på immunofluorescens och immunoprecipitation tekniker, med betoning av kritiska moment och fallgropar för autofagi forskning, liksom felsökningsförslag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunoprecipitation och immunofluorescens tekniker är avgörande för studien av protein-protein interaktioner. Även om dessa två tekniker är vanliga och väletablerade, flera kriterier bör övervägas att definiera kvaliteten på experiment medan du använder dessa tekniker.
Första, primära antikroppar som används i dessa tester bör vara specifika för proteinerna av intresse. För att säkerställa detta, använda shRNA knockdowns eller knockout celler för att testa specificiteten …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av vetenskaplig och teknisk forskning rådet av Turkiet (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, Sabanci University. SEB och NMK stöds av ett TUBITAK BIDEB 2211 stipendium för Ph.D. studier.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
