Fluorescens in situ hybridisering (FISH) krävs ofta i kombination med histopatologi och molekylär diagnostik för val av terapi i personlig medicin. En ny icke-cross-länkar, formalin-fri vävnad fixativ som tillåter hög kvalitet morphologic, molekylär och fisk analyser från samma prov genom tillsats av en efter fixering steg innan fisken läggs fram.
Morphologic bedömning av formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) vävnadsprover har varit guldmyntfoten för cancerdiagnostik i årtionden på grund av dess utmärkta bevarande av morfologi. Personlig medicin ger alltmer individuellt anpassade och riktade terapier för kännetecknas enskilda sjukdomar som aktiveras av kombinerade morfologiska och molekylära analytiska tekniker och diagnostik. Prestanda av morfologiska och molekylära analyser från det samma FFPE-provet är utmanande på grund av de negativa effekterna av formalin på grund av kemisk modifiering och cross-linking av nukleinsyror och proteiner. En icke-cross-länkar, formalin-fri vävnad fixativ utvecklats nyligen att uppfylla både kraven, dvs., att bevara morfologi som FFPE och biomolekyler som cryo-bevarande. Eftersom fisk krävs ofta i kombination med histopatologi och molekylär diagnostik, testade vi tillämpligheten av fisk protokoll på vävnader som behandlats med denna nya fixativ. Vi hittade den formalin efter fixeringen av histologiska sektioner av icke-cross-länka, formalin-fri och paraffin-inbäddat (NCFPE) bröst cancer vävnad genererat likvärdiga resultat som de med FFPE-vävnad i human epidermal tillväxtfaktor receptor 2 (HER2) FISK analys. Det här protokollet beskriver hur en fisk assay ursprungligen utvecklats och validerats för FFPE-vävnad kan användas för NCFPE vävnader av en enkel efter fixering steg av histologiska sektioner.
Personlig medicin är alltmer beroende av flera parametrar tester där morfologiska och molekylära vävnad analyser. Formalin fixering av vävnader som den gyllene standarden ger utmärkt morphologic kvalitet1,2. Dock stör formalin-inducerad kemisk modifiering och cross-linking av proteiner och nukleinsyror3,4,5 negativt molekylär analys6. Dessa molekylära ändringar begränsa kvalitet nukleinsyror och proteiner och kan resultera i gen sekvens artefakter7 eller känselnedsättning av polymeras-kedjereaktion (PCR)-baserade analyser8. Även om stora ansträngningar har vidtagits för att optimera molekylära tester för FFPE-vävnad, är cryo-bevarande av vävnader i allmänna överlägsen formalin fixering, vilket gör det nödvändigt att dela upp vävnadsprover för olika bevarande förfaranden. För att undvika behovet av cryo-bevarande för molekylära analyser, en icke-cross-länka, formalin-fri fixativ, PAXgene vävnad utvecklades. Kommersiellt tillgängliga systemet består av en fixering och en stabilisering lösning innehållande olika alkoholer, ättiksyra och en löslig organisk förening. Korrekt bevarande av nukleinsyror, proteiner (phospo) och morfologi visades i flera studier6,9,10,11,12,13.
Ett visst program i cancerdiagnostiken är fisk att upptäcka ett omfattande sortiment av kromosomala förändringar, såsom flyttningar, submikroskopiska strykningar och kompletteringar 14. Till exempel tjugo procent av invasiv bröstcancer tumörer Visa förstärkning av human epidermal tillväxtfaktor receptor 2 (HER2) genen15,16,17, som är associerad med dålig prognos18 ,19. Fastställande av HER2 överuttryck och förstärkning status i bröstcancer av fisk behövs att välja patienter för behandling med anti-HER2-regi och är en följeslagare diagnostiska som anges av Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. För att möjliggöra en bred tillämpning av fiskbaserade följeslagare diagnostik inom vård och omsorg, analyser utvecklades och godkänd för FFPE vävnader.
I en tidigare studie visade vi att NCFPE vävnader inte kan användas för FISH-analyser som har godkänts för FFPE-vävnad. Men uppnått tester tid rad olika inlägg fixering förfaranden av NCFPE vävnader med 4% buffrad formaldehyd visade att bokföra fixering gånger på 18 h eller längre av NCFPE vävnadssnitt likvärdiga resultat som de med FFPE vävnader14.
I denna studie vi tillhandahålla ett detaljerat protokoll och Visa effekterna av icke-cross-länkar, formalin-fri vävnad fixering och 24 h 4% buffrad formaldehyd efter fixering vid sektioner används för HER2 FISH och RNA kvalitet från samma primära vävnad preparatet.
Figur 1: diagrammet visar stegen för fluorescens i situ hybridisering (FISH) och RNA analys av formalinbeständiga paraffin inbäddade (FFPE) och icke-cross-länkar, formalin-gratis fast paraffin inbäddat (NCFPE) vävnader. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Resultaten visar två viktiga resultat. Först är en enkel 24 h Mikaels efter fixering steg i avsnitt klippt från NCFPE vävnader tillräckliga för att uppnå likvärdiga resultat som de med FFPE i fisk analyser med hjälp av FISH-analyser som godkänts för FFPE vävnader (se även referens14). Detta protokoll har fördelen av att använda fisk analyser ursprungligen utvecklade och godkända för FFPE utan behov av omfattande förnyelse (t.ex. genom att optimera före hybridisering villkoren för icke-kors-länkade vävnad). FISK protokollet kan användas precis som beskrivs i tillverkarens instruktioner.
Mindre ändringar från tillverkarens anvisningar i detta protokoll (t.ex. vävnad avsnitt diameter och inkubation perioder på avparaffinering stegen) resultat från tidigare anpassningar, vilket uttryckligen rekommenderas av tillverkaren på grund av användningen av olika vävnadstyper och fixering metoder.
Steget efter fixering är avgörande eftersom det kräver en kemisk reaktion tid 18-24 h, som utökar analys tid genom en dag men tillåter samma dagliga arbetsflöde som utvecklats för FFPE vävnader (figur 1). Mikaels rapporteras att penetrera vävnad i genomsnitt 1 mm per timme22 till 5 mm i 2 h beroende på den vävnad typ23,24. Observationen att endast längre efter fixering perioder av mer än 18 h kunde ändra egenskaperna för NCFPE till FFPE sektioner, indikerar att inte genomträngningen av fixeringsvätskan men den kemiska reaktion tid är avgörande för att uppnå de önskade resultaten1 ,14.
För det andra kan den återstående NCFPE vävnad som inte används för efter fixering användas för ytterligare molekylära analyser som biomolekyler är väl bevarade. Detta visades av realtid omvänd Transkription PCR (figur 3). Analysen är mer känslig och specifik än elektroferogram-derived RIN värdet (RNA integritet nummer) när det gäller RNA kvalitet (dvs. kemisk modifiering och fragmentering) för mRNA isolerade från paraffin-inbäddat vävnader8. Kvalitetskontrollen var begränsad i denna studie till realtids-PCR eftersom oberoende grupper har visat att förutom RNA, DNA och proteiner isolerade från NCFPE kvalitet är bättre än från FFPE vävnader 8,9, 13.
Protokollet presenteras följer, i tillämpliga fall (t.ex. Mikaels recept, fixering villkor, RNA kvalitetskontroll, validering), kraven i de tekniska specifikationerna för CEN för pre analytiska förfaranden för in vitro – diagnostik (IVD), som har nyligen släppts av Europeiska kommittén för standardisering (CEN) (t.ex. CEN/TS 16827-1: 2015 för RNA-isolering från FFPE-vävnad som hänvisar till standarden ISO 15189).
Metoden är begränsad till denna specifika fixativ. Även om bra bevarandet av biomolekyler och morfologi använder icke-cross-länkar, formalin-fri fixeringsvätskan har presenterats i flera studier, används det främst i forskning men inte i rutinmässiga medicinska tillämpningar. En anledning är att ersätta guldmyntfoten Mikaels fixering av en annan fixativ skulle kräva en mängd valideringsstudier som inte alla protokoll optimerad för FFPE material kan användas för material fast med icke-cross-länka fixativ. Andra vävnad fixering metoder inte har testats för denna fisk-protokollet.
Den enkla efter fixering steg som beskrivs i detta manuskript har fördelen med att använda IVD godkända analyser både för FFPE och NCFPE vävnader.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar laget av laboratoriet för molekylär patologi vid Institutet för patologi medicinska universitetet Graz för sin kompetens och stöd. Dessutom tackar vi Iris Kufferath och Daniela Pabst för tekniskt bistånd, Bernadette Rieger och Sylvia Eidenhammer för bearbetning av fall som HER2 och Kinga Szurian (patolog) samt Tamas Regényi (3DHISTEC). Vi tackar Penelope Kungl för korrekturläsning manuskriptet. Detta arbete har fått ekonomiskt stöd av Christian Doppler forskningsfonden, den österrikiska federala ministeriet för vetenskap, forskning och ekonomi och nationella Stiftelsen för forskning, teknik och utveckling.
SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany | www.sav-lp.de | FN-200L-4-1 | Tissue fixative |
Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada | www.simport.com | M-498 | Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples. |
Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 765112 | For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER. |
ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 813150 | Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration |
Merck Millipore, Munich, Germany | www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html | MC1009834000 | Dehydration of tissue samples |
VWR Chemicals, Darmstadt, Germany | https://at.vwr.com | 10293EP | Dehydration of tissue samples |
ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria | www.herba-chemosan.at | 2549662 32 | Paraffin used in a tissue processing device |
Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria | www.LeicaBiosystems.com | 39602004 | Paraffin embedding medium |
Sanova Diagnostik, Vienna, Austria | www.sanova.at | 5229 | Paraffin embedding instrument for tissues for histology |
Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria | www.histocom.info | M 910010 | This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument. |
Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark | www.chem.agilent.com | K802021-2 | Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. |
Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 73504 | For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections |
Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 765134 | For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections |
ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany | www.zytovision.com | Z-2015-200 | For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples. |
3DHISTEC, Budapest, Hungary | www.3dhistech.com | Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera. | |
ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 4368814 | The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction. |
ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 4367659 | PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons. |
ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE | www.thermofisher.com | Ser. Nr. F239 | Spectrophotometer for nucleic acid quantification. |
QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System | www.thermofisher.com | 4485701 | PCR machine, |
Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A | www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order | e.g. (ThermoBrite) 07J91-020 | Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures. |