Ultrahög upplösning mus optisk koherenstomografi till stöd intraokulär injektion i näthinnans genterapi forskning
Summary
Här visar vi en ny metod att hjälpa leverans av gene therapy agenter i subretinalområdet, bedöma dess areala täckning och karakterisera ljusmätare vitalitet med hög upplösning spektral-domän optisk koherenstomografi (HR-SD-okt).
Abstract
HR-SD-okt utnyttjas att övervaka utvecklingen av ljusmätare degeneration i levande musmodeller, bedöma distribution av terapeutiska medel i subretinalområdet och utvärdera toxicitet och effekt i vivo. HR-SD-okt använder nära infrarött ljus (800-880 nm) och har optik speciellt utformad för de unika optiken på möss med sub-2-micron axiella upplösning. Transgena musmodeller av yttre retinal (ljusmätare) degeneration och kontroller var avbildas för att bedöma sjukdomsförloppet. Draget glas mikronålar användes för att leverera sub retinal injektioner av adeno-associerade virus (AAV) eller nanopartiklar (NP) via en trans-skleral och trans-koroidal strategi. Noggrann positionering av nålen i subretinalområdet krävdes före en kalibrerad injektion, som levererar vätska in i sub retinal utrymme. Realtid subretinal kirurgi utfördes på våra retinal imaging system (RIS). HR-SD-okt visat progressiva enhetliga näthinneförtvining på grund av uttryck av ett giftigt muterade mänskliga mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgenens hos möss. HR-SD-okt tillåter rigorösa kvantifiering av alla retinala lagren. Yttre nukleära lagret (Onlinekanaler) tjocklek och ljusmätare yttre segment längd (OSL) mätningar korrelerar med ljusmätare vitalitet, degeneration eller räddning. RIS leveranssystemet tillåter realtid visualisering av subretinal injektioner i neonatal (~ P10-14) eller vuxna möss, och HR-SD-okt omedelbart avgör framgången för leverans och kartor areala omfattning. HR-SD-okt är ett kraftfullt verktyg som kan utvärdera framgången av subretinal kirurgi i möss, i tillägg till att mäta vitalitet av fotoreceptorer i vivo. HR-SD-okt kan också användas för att identifiera enhetliga djur kohorter för att bedöma omfattningen av retinal degeneration, toxicitet och terapeutiska räddning i prekliniska gen terapi forskningsstudier.
Introduction
Forskare utvecklar genterapi för en mängd olika retinala och retinala degenerativa sjukdomar med förhoppningar om att översätta roman therapeutics till behandlingar för mänskliga sjukdomar1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. tid domän eller spektrala domänen optisk koherenstomografi (SD-okt) har använts för att undersöka aspekter av yttre retinal degeneration i specifika musmodeller av sjukdom12,13,14 . HR-SD-okt har dock inte i stor utsträckning används i samband med optimera utvärdering av musmodeller för att bestämma hastigheten och rumsliga enhetlighet av retinal degeneration, eller i samband med preklinisk utvärdering av genen baserat therapeutics, till exempel till bedöma räddning, toxicitet eller den rumsliga utsträckning vektor leverans8,15,16. När en musmodell kännetecknas fullt, kan HR-SD-okt data fungera som en informativ och pålitlig resurs för att mäta effekten av therapeutics att utöva undsättnings- eller toxicitet i musmodeller av retinal degeneration17. Många grupper använder subretinal injektion som en metod för vektor leverans på grund av dess effektivitet på transducing fotoreceptorer och retinal pigment epitel (RPE) celler. Men detta är fortfarande en svår metod att bemästra, med tanke på att det görs vanligtvis av fri hand kirurgi från hornhinnans yta, och ofta förenat med grå starr, blödning och oavsiktliga retinala avskildhetar sker enkelt genom manipulation av bakre glaskroppen. Många grupper fortfarande försöka subretinal injektioner blint och leverera den virus användande manuell injektioner med relativt stor diameter rostfria nålar (34G)8,17,18,19 ,20,21,22, och några använder optisk koherenstomografi (ULT) imaging för att bekräfta korrekt leverans av vektor till näthinnan8,17, 20 , 22. några förbättringar i metoden har nyligen beskrivits med hur provtagningsutrustningen skall nålar drivs av en micromanipulator22.
Vi presenterar en integrerad strategi som hjälpmedel för positionering av nålen och injektionerna underlättas av en anpassad riktad stereo oftalmoskop utformad i labbet specifikt för att visualisera den små ögat av mus17, 23. de drog glas mikro nålar i samband med den stereotaxic micromanipulator ger bättre kontroll över nålen placering med inga kirurgiska skära ner krävs (dvs. genom konjunktiva och bindväv) före injektion. Användning av trycket regleras micro injektor hjälper leverera konsekvent injektionsvolymer och injektionen kan göras med mycket större stabilitet, precision och mycket långsammare än manuell injektioner utförs av en handhållen spruta, därmed minskar den förekomsten av bubbla injektion i ögat. Mindre nålen förhindrar läckage efter nålen uttag eftersom sökvägen är självtätande. För att bedöma omfattningen av injektion/leverans, många undersökande grupper förlita sig på att finna och bedöma areala omfattning förbättrade grön fluorescens-proteinuttryck (andra) i näthinnan (uttryck konstruktion levereras av vektorn) experimentella i slutet punkt (eutanasi) för att bekräfta lyckad injektioner11,19,20,24. Detta tillvägagångssätt (inte utnyttja OCT) för att verifiera kirurgiska framgång avfall en enorm mängd resurser i kirurgiska processuella tid och djur, eftersom alla djur med (okänd) kirurgiska fel behöver underhållas, följt med repetitiva åtgärder tills dödshjälp och ögat skörd (när andra mäts). Bekräftelse på platsen för injektion i näthinnan kan förbättras med hjälp av HR-SD-okt för att demonstrera att injektionen ligger mellan rätt lager av näthinnan (dvs subretinalområdet). HR-SD-okt kan också användas för att omedelbart avgränsa misslyckade försök (kirurgiska fel) att identifiera relevanta variabler i riktig kirurgisk tid att förbättra metoden. Vi hittade att HR-SD-okt ger många fördelar i prekliniska gen terapi studier genom att låta snabba kvantitativa utvärderingen av yttre retinal degeneration, möjliggör identifiering/utslaktning av studien djur som inte uppfyller experimentella kriterier ( t.ex. Felaktiga subretinal injektion), och att direkt uppföljning imaging att regionen i ögat där vector levererades (där prekliniska effekt är mest sannolikt) samt styra regioner där vektorn inte levererades. Sedan dess utveckling, användning av SD-okt har fortsatt att accepteras och används av oftalmologi forskare och anses nu standarden på retinal imaging i näthinnans vetenskapliga studier i musen eller gnagare modeller13,25. HR-SD-okt och dess programvara kapacitet utnyttjades i unika integrerade sätt att främja målet med framgångsrika kvantitativ genterapi i musmodeller vid varje steg i processen, inklusive djurmodell urval, karakterisering av degeneration i valda sjukdomsmodeller, terapeutiska leverans, kartläggning vektor leveranssätt och toxicitet/effekt utvärdering. Användning av HR-SD-okt möjliggör effektivare läkemedelsutveckling på varje nivå av processen. Här beskriver vi dessa metoder som används i vårt RNA Drug Discovery program.
Protocol
Representative Results
Discussion
HR-SD-okt ger en enkel metod för karakterisering av potentiella djurmodeller av mänskliga sjukdomar att bestämma deras användbarhet i testning potentiella therapeutics. Förmågan att snabbt och tillförlitligt karakterisera en potentiell djurmodell av mänskliga sjukdomar är avgörande för processen för terapeutiska läkemedelsutveckling (t.ex., ersättare genterapi, ribozym eller shRNA knockdown genterapi, kombinerade genterapi). HR-SD-okt ger en enkel, snabb och icke-invasiv metod för att utvärdera r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta material bygger på arbete som stöds, delvis av institutionen av veteraner frågor (VA), Veterans Health Administration, kontor för forskning och utveckling (biomedicinsk laboratorieforskning och utveckling) (VA Merit Grant 1I01BX000669). JMS är anställd, delvis som personalen läkare-forskare, oftalmologi, VA WNY; MCB är anställd, delvis av VA WNY. Studien genomfördes på, och delvis med stöd av Veterans Administration Western New York hälso-systemet (Buffalo, NY). Innehållet representerar inte åsikter Department of Veterans Affairs eller Förenta staternas regering. Stödde också, i större delen av NIH/NEI R01 bevilja EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 bevilja EY016662 (UB Vision infrastruktur Center, PI: M slakt, direktör – Biofotonik Module: JMS), ett fritt bidrag till avdelningen för oftalmologi/universitetet i Buffalo från forskning till förhindra blindhet (New York, NY), och ett bidrag från stiftelsen Oishei (Buffalo, NY). Vi erkänner gåva hC1 transgena RHOP347S linjen och exon 1 musen RHO knockout från Dr. Janis Lem (Tufts New England Medical Center, Boston, MA), och gåvan av NHR-E transgenens modellen i heterozygot staten på den mus exon 2 RHO knockout bakgrund från Drs. G. Jane Farrar och Peter Humphries (Trinity College, Dublin, Irland).
Materials
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
- Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
- Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
- Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
- Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).
- Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
- Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
- Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
- Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
- Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9 (2015).
- Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).
- Berger, A., al, , et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , (2013).
- Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
- Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).
- Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).
- Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
- Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
- Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).
- Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
- Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
- Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
- Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
- Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
- Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
- Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
- Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).
