Ultrahigh opløsning musen optisk kohærens tomografi til støtte intraokulært injektion i Retinal genterapi forskning
Summary
Her viser vi en ny tilgang til at bruge høj opløsning spektral-domæne optisk kohærens tomografi (HR-SD-OCT) at hjælpe levering af genet terapi agenter ind i subretinal rummet, vurdere dens areal dækning og karakterisere fotoreceptor vitalitet.
Abstract
HR-SD-okt er udnyttet til at overvåge progression af fotoreceptor degeneration i levende musemodeller, vurdere levering af terapeutiske agenter ind i subretinal rummet og evaluere toksicitet og effektivitet i vivo. HR-SD-OLT anvender nær infrarødt lys (800-880 nm) og har optik specifikt designet til unik optik af musen øjet med sub-2-micron aksial opløsning. Transgene musemodeller af ydre retinal (fotoreceptor) degeneration og kontrol blev afbildet for at vurdere sygdomsprogression. Trak glas microneedles blev brugt til at levere sub retinal injektioner af adeno-associeret virus (AAV) eller nanopartikler (NP) via en trans-scleral og trans-choroidal tilgang. Omhyggelig placering af nålen ind i subretinal rummet var påkrævet før en kalibreret trykket indsprøjtning, som leverer væske ind i sub retinal rummet. Realtid subretinal operation blev udført på vores retinal imaging system (RIS). HR-SD-okt demonstreret progressive ensartet retinal degeneration som følge af udtryk af en giftig mutant menneskelige mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgenet i mus. HR-SD-okt tillader strenge kvantificering af alle de retinale lag. Ydre nukleare lag (ger.) tykkelse og fotoreceptor ydre segment længde (OSL) målinger korrelerer med fotoreceptor vitalitet, degeneration eller redning. RIS leveringssystem giver mulighed for real-time visualisering af subretinal injektioner i neonatal (~ P10-14) eller voksne mus og HR-SD-okt straks afgør succes af levering og kort areal omfang. HR-SD-okt er et kraftfuldt værktøj, der kan evaluere succesen af subretinal kirurgi i mus, desuden at måle vitalitet af fotoreceptorer in vivo. HR-SD-OLT kan også bruges til at identificere ensartede dyr kohorter for at vurdere omfanget af retinale degeneration, toksicitet og terapeutiske redning i prækliniske gen terapi forskningsundersøgelser.
Introduction
Forskere udvikler genterapier for en lang række retinal og retinal degenerative sygdomme med håb om at omsætte roman therapeutics til behandlinger for human sygdom1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. tid domæne eller spektral domæne optisk kohærens tomografi (SD-OCT) er blevet brugt til at undersøge aspekter af ydre retinal degeneration i specifikke musemodeller sygdom12,13,,14 . HR-SD-OLT ikke dog været flittigt brugt i forbindelse med optimering af evaluering af musemodeller til beregning af sats og rumlige ensartethed af retinale degeneration, eller i forbindelse med præklinisk evaluering af genet baseret therapeutics, for eksempel, til vurdere redning, toksicitet, eller den rumlige udstrækning vektor levering8,15,16. Når en musemodel er fuldt karakteriseret, kan HR-SD-okt-data tjene som en informativ og pålidelig ressource til at måle virkningen af therapeutics at udøve redning eller toksicitet i musemodeller af retinale degeneration17. Mange grupper bruger subretinal injektion som en metode til vektor levering på grund af dens effektivitet på transducing fotoreceptorer og retinale pigment epitel (ÅV) celler. Dette er imidlertid en vanskelig metode til master, eftersom det gøres typisk ved fri hånd kirurgi fra hornhindens overflade, og er ofte behæftet med grå stær, blødning og utilsigtede retinal forsyningslinier opstår simpelthen ved manipulation af bageste glaslegemet. Mange grupper stadig forsøge subretinal injektioner blindt og levere den virus benytter manuel injektioner med relativt stor diameter rustfrit stål nåle (34G)8,17,18,19 ,20,21,22, og et par bruger optisk kohærens tomografi (OCT) imaging for at bekræfte korrekte levering af vektor til nethinden8,17, 20 , 22. nogle forbedringer i metoden er for nylig blevet beskrevet ved hjælp af individuel nåle drevet af en micromanipulator22.
Vi præsenterer en integreret tilgang, som hjælper i placeringen af nålen, og injektioner er lettet af en brugerdefineret styret stereo oftalmoskop designet i lab specifikt til at visualisere inde i små øjet af musen17, 23. brugen af trak glas mikro nåle sammenholdt med den stereotaxisk micromanipulator giver bedre kontrol af nålen placering med ingen kirurgisk skåret ned krævede (dvs. gennem bindehinden og bindevæv) forud for injektion. Brug af presset reguleret mikro injektor hjælper med at levere konsekvent injektionsvolumener, og injektion kan gøres med meget større stabilitet og præcision, og meget langsommere end manuel injektioner udført af en håndholdt sprøjte, dermed mindske den forekomst af boble injektion i øjet. Mindre nålen hjælper med at forhindre lækage efter nålen tilbagetrækning, fordi stien er selvstændige forsegling. For at vurdere omfanget af indsprøjtning/levering, stole mange undersøgende grupper på at finde og vurdere areal omfanget af forbedrede grønne fluorescens protein (EGFP) udtryk i nethinden (udtryk konstruere leveret af vektoren) i eksperimentel slutningen punkt (eutanasi) for at bekræfte vellykket injektioner11,19,20,24. Denne tilgang (ikke udnytte OCT) til at kontrollere kirurgisk succes spilder en enorm mængde af ressourcer i kirurgisk proceduremæssige tid og dyr, da alle dyr med (ukendt) kirurgisk fiaskoer skal bibeholdes, følges med gentagne foranstaltninger indtil aktiv dødshjælp og øjet høst (når EGFP er målt). Bekræftelse af placeringen af injektion i nethinden kan forbedres ved hjælp af HR-SD-OCT til at vise, at Indsprøjtningen er placeret mellem de korrekte lag af nethinden (dvs. den subretinal plads). HR-SD-OLT kan også bruges til straks at afgrænse mislykkede forsøg (kirurgiske fejl) at identificere relevante variabler i ægte kirurgisk tid til at forbedre tilgangen. Vi fandt, at HR-SD-okt giver adskillige fordele i prækliniske gen terapi undersøgelser ved at tillade hurtig kvantitative evaluering af ydre retinal degeneration, så identifikation/nedslagtning af undersøgelse dyr, der ikke opfylder eksperimentelle kriterier ( fx forkert subretinal injektion), og at direkte opfølgning imaging til regionen i øjet hvor vektor blev leveret (hvor prækliniske effekten er mest sandsynligt) samt styre regioner hvor vektoren ikke blev leveret. Siden sin udvikling, brugen af SD-okt fortsatte med at blive accepteret og anvendt af oftalmologi forskere og betragtes nu som standard af retinale imaging i retinal videnskabelige studier i mus eller gnavere modeller13,25. HR-SD-OCT og dens softwarefunktioner blev udnyttet i unikke integrerede måder at yderligere mål for vellykket kvantitativ genterapi i musemodeller på hvert trin i processen, herunder dyremodel udvalg, karakterisering af degeneration i valgte sygdomsmodeller, terapeutiske levering, kortlægning af vektor levering og toksicitet/effekt evaluering. Brugen af HR-SD-okt giver mulighed for mere effektiv drug discovery på alle niveauer af processen. Her beskriver vi disse metoder, der anvendes i vores RNA Drug Discovery program.
Protocol
Representative Results
Discussion
HR-SD-okt giver en simpel metode til karakterisering af potentielle dyremodeller for sygdom hos mennesker til at bestemme deres anvendelighed i test potentielle therapeutics. Evnen til hurtigt og pålideligt karakterisere en potentiel dyremodel af human sygdom er afgørende for processen med terapeutisk drug discovery (fx, udskiftning genterapi, ribozym eller shRNA knockdown genterapi, kombinerede genterapi). HR-SD-okt giver en enkel, hurtig og ikke-invasiv metode til evaluering retinal sundhed, der kan bruges t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette materiale er baseret på arbejde delvist, understøttet af Institut for veteraner anliggender (VA), Veterans Health Administration, Office for forskning og udvikling (Biomedicinsk Laboratorium forskning og udvikling) (VA Merit Grant 1I01BX000669). JMS er ansat, dels som ansatte læge-videnskabsmand, oftalmologi, af VA WNY; MCB er delvis ansat af VA WNY. Undersøgelsen blev gennemført på, og støttet delvis af Veterans Administration Western New York Healthcare System (Buffalo, NY). Oplysningerne repræsenterer ikke synspunkter Department of veterananliggender eller de Forenede Staters regering. Støttede også, i store del, ved NIH/NEI R01 giver EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 give EY016662 (UB Vision infrastruktur Center, PI: M slagtning, direktør – Biophotonics modul: JMS), en ubegrænset tilskud til Institut for oftalmologi/Universitet på Buffalo fra forskning til at forebygge blindhed (New York, NY), og et tilskud fra Oishei Foundation (Buffalo, NY). Vi anerkender gaven af hC1 transgene RHOP347S linje og exon 1 musen RHO knockout fra Dr. Janis Lem (totter New England Medical Center, Boston, MA), og gaven af Knud-E transgen model i den heterozygous stat på den musen exon 2 RHO knockout baggrund fra Drs. G. Jane Farrar og Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).
Materials
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
- Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
- Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
- Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
- Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).
- Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
- Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
- Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
- Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
- Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9 (2015).
- Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).
- Berger, A., al, , et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , (2013).
- Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
- Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).
- Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).
- Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
- Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
- Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).
- Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
- Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
- Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
- Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
- Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
- Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
- Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
- Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).
