הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים
Summary
ההתקדמות האחרונות ביכולת לתמרן גנטית קווי תאים סומטיים להחזיק פוטנציאל גדול עבור מחקר בסיסי ויישומי. כאן, אנו מציגים שתי גישות עבור CRISPR / Cas9 שנוצר נוקאאוט הייצור והקרנה שורות תאים יונקים, עם וללא שימוש סמנים לבחירה.
Abstract
מערכת ההנדסה הגנטית של CRISPR / Cas9 חוללה מהפכה ביולוגית בכך שהיא מאפשרת עריכה מדויקת של הגנום עם מעט מאמץ. מודרך על ידי מדריך יחיד RNA (sgRNA) המעניק סגוליות, חלבון Cas9 cleaves שני גדילי DNA ב מוקד ממוקדת. ההפצה DNA יכול להפעיל או שאינם הומולוגיים סוף שהצטרף (NHEJ) או הומולוגיה מכוונת לתקן (HDR). NHEJ יכול להציג מחיקות קטנות או הוספות אשר להוביל מוטציות מסגרת משמרת, בעוד HDR מאפשר הפרעות גדול יותר מדויק. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להפקת קווי תא נוקאאוט על ידי צימוד הוקמה CRISPR / Cas9 שיטות עם שתי אפשרויות לבחירה במורד / הקרנה. הגישה NHEJ משתמשת באתר חיתוך יחיד sgRNA ובחירה עצמאית הבחירה, שבו ייצור החלבון מוערכת על ידי אימונובלוט נקודה בצורה תפוקה גבוהה. הגישה HDR משתמש בשני sgRNA לחתוך אתרים כי טווח הגן של עניין. יחד עם תבנית HDR בתנאי, שיטה זו יכולה להשיג מחיקהשל עשרות kb, בסיוע סמן התנגדות לבחירה לבחירה. היישומים והיתרונות המתאימים של כל שיטה נדונים.
Introduction
שינויים גנטיים יציבים מספקים יתרון על פני שיטות חולפות של הפרעות סלולר, אשר יכול להיות משתנה ביעילות שלהם משך. עריכה גנומית הפכה נפוצה יותר ויותר בשנים האחרונות עקב התפתחות של נוקלאזות ספציפיות למטרה, כגון נוקלאזות של אבץ אצבע , 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , ו RNA מונחה נוקלאזות הנגזרות, מקובצים בקביעות interinded קצר palindromic חוזר (CRISPR) מערכת 10 .
CRISPR / Cas9 מכונות העריכה מותאמת מתוך המערכת החיסונית כי חיידקים ארכאי להשתמש כדי להגן מפני זיהומים ויראלייםהתחת = "xref"> 11 , 12 , 13 . בתהליך זה, קצרים, 20-30 nt שברי רצף ויראלי פולש משולבים לתוך לוקוס גנומי כמו "מרווחים" מוקף יחידות חוזרות 14 , 15 . תעתיק לאחר עיבוד RNA מייצר קטן CRISPR הקשורים RNAs 16 (crRNAs) כי, יחד עם הפעלת crRNA 17 (tracrRNA) מפעיל, להרכיב עם endonuclease Cas9 effector. CRRNAs ובכך לספק ספציפיות למיקוד Cas9, המנחה את המתחם לדבק רצפים דנ"א ויראלי משלימה ומניעת זיהומים נוספים 18 , 19 . כל רצף "protospacer" בדנ"א ממוקד יכול לשמש כמקור של ה- CRRNA, כל עוד הוא ישירות 5 'כדי מוטיב קצר סמוך protospacer (PAM), NGG במקרה של S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. העדר רצף ה- PAM ליד המרווח באזור של ה- CRISPR המארח מבדיל בין העצמי לבין הלא-עצמי, ומנע את המיקוד של המארח. בגלל האוניברסליות והגמישות שלה, מערכת ביולוגית זו הותאמה בעוצמה לעריכה גנומית, כך שכמעט כל אתר דנ"א הצמוד ל- PAM יכול להיות ממוקד. בגרסה זו, שינוי נוסף התמזגו crRNA ו tracrRNA לתוך RNA מדריך יחידה (sgRNA) רכיב נטען לתוך חלבון Cas9 21 .
עם הביטוי של Cas9 ו sgRNA בתאים אוקריוטים, חלבון Cas9 cleaves שני גדילי דנ"א על מוקד ממוקדת. בהיעדר אזור מתאים של רצף הומולוגי, התא מתקן את ההפסקה הזאת באמצעות חיבור לא הומולוגי (NHEJ) 22 , 23 , 24 , אשר בדרך כלל מציג מחיקות קטנות או, לעתים נדירות, כניסות. בעת מיקוד פתוחמסגרת הקריאה, התיקון עלול להוביל frameeshift translational שמייצר מוצר חלבון שאינו פונקציונלי. לעומת זאת, כאשר מסופק עם תבנית אקסוגני עם אזורים גדולים של הומולוגיה, התא יכול לתקן את הפער פעמיים גדיל על ידי הומולוגיה מכוונת לתקן 25 , 26 . נתיב זה מאפשר מחיקות מדויקות יותר, תחליפים או הוספות בגנום, יחד עם הכנסת סמני הבחירה הנבחרים 27 .
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים ליצירת שורות תאים נוקאאוט על ידי אחד משני אלה CRISPR / Cas9 שיטות ( איור 1 א ). הגישה NHEJ משתמשת באתר חיתוך יחיד sgRNA ובחירה עצמאית ההקרנה, ולכן דורש הכנה מראש upfront. בעת שימוש בשיטה זו, מדריך RNAs משלימים אקסונים ליד הקצה 5 'של התמליל, אשר סביר להניח לייצר נוקאאוט, חייב להיות מתוכנן. מאז modificatיונים לגנום במקרה זה הם קטנים, ההקרנה שיבוטים נוקאאוט מבוסס על כתמים נקודה, שבו המוצר חלבון מוערך בצורה תפוקה גבוהה. אנו משתמשים בדוגמה של ELAVL 1 כמו חלבון 1 (ELAVL1). הגישה השנייה מסתמכת על תיקון הומולוגיה מכוונת (HDR) ומשתמשת בשני אתרי חיתוך sgRNA המשתרעים על פני הגן או אזור העניין, ומאפשרים מחיקות של עשרות קילובייט. פלסמיד עם שני אזורים של הומולוגיה כי האגף אתרי מחשוף מספק תבנית תחליף ( איור 1B ), מציגה סמן התנגדות לבחירה כי מגביר את היעילות של הדור נוקאאוט. שיטה זו יכולה גם להיות מותאם כדי להציג שינויים גנים עם זרועות הומולוגיה מתוכנן כראוי. במקרה זה, שילוב של קטע DNA חדש מאפשר סינון מבוסס PCR ( איור 1C ). כאן, אנו משתמשים הדור של Pumilio RNA מחייב בן משפחה 2 (PUM2) נוקאוט שורות כדוגמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת CRISPR / Cas9 אפשרה ייצור יעיל של שינויים גנומיים יציבים, המספקים חלופה עקבית יותר לשיטות מניפולציה אחרות. הנה, הצגנו שתי שיטות לזיהוי מהיר של CRISPR / Cas9 גן knockouts בקווים תא יונקים. שתי השיטות דורשות חומר סלולרי קטן, ולכן הבדיקה יכולה להתבצע בשלבים המוקדמים של התרבות המשו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים היו רוצים להודות Gissell Sanchez, מייגן לי, וג 'ייסון Estep לסיוע ניסיוני, וייפנג גו ו Xuemei חן על שיתוף ריאגנטים.
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
