Udvælgelsesafhængig og uafhængig generering af CRISPR / Cas9-medierede Gene Knockouts i Pattedyrceller
Summary
Nylige fremskridt i evnen til at genetisk manipulere somatiske cellelinier har stort potentiale for grundlæggende og anvendt forskning. Her præsenterer vi to metoder til CRISPR / Cas9 genereret knockout produktion og screening i pattedyrcellelinjer, med og uden brug af selekterbare markører.
Abstract
CRISPR / Cas9 genomteknik systemet har revolutioneret biologi ved at tillade præcis genom redigering med lidt indsats. Guided af en enkelt guide RNA (sgRNA), der giver specificitet, spalter Cas9-proteinet begge DNA-tråde på det målrettede sted. DNA-pause kan udløse enten ikke-homolog slutningen (NHEJ) eller homologi-rettet reparation (HDR). NHEJ kan introducere små sletninger eller insertioner, der fører til rammeskift mutationer, mens HDR muliggør større og mere præcise forstyrrelser. Her præsenterer vi protokoller til generering af knockout-cellelinjer ved at kombinere etablerede CRISPR / Cas9 metoder med to muligheder for downstream-udvælgelse / screening. NHEJ-tilgangen anvender et enkelt sgRNA-cut-site og selektionsuafhængig screening, hvor proteinproduktion vurderes ved prik-immunoblot på en høj gennemstrømningsmåde. HDR-fremgangsmåden anvender to sgRNA-cut-sites, der spænder over genet af interesse. Sammen med en leveret HDR-skabelon kan denne metode opnå sletningAf titus kb, hjulpet af den indsatte valgbare resistansmarkør. De relevante applikationer og fordele ved hver metode diskuteres.
Introduction
Stabile genetiske ændringer giver en fordel i forhold til transiente metoder til cellulær forstyrrelse, som kan variere i deres effektivitet og varighed. Genomisk redigering er blevet mere og mere almindelig de seneste år som følge af udviklingen af målspecifikke nukleaser, såsom zinkfinger-nukleaser 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , transkriptionsaktivator-lignende effektor-nucleaser (TALEN'er) 6 , 7 , 8 , 9 Og RNA-styrede nucleaser afledt fra de klyngede, regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) system 10 .
CRISPR / Cas9-redigeringsmaskinen er tilpasset et immunsystem, som bakterier og archaea bruger til at forsvare mod virusinfektionerAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . I denne proces inkorporeres korte 20-30 nt-fragmenter af invaderende virussekvens i et genomisk locus som "afstandsstykker" flankeret af gentagende enheder 14 , 15 . Efterfølgende transkription og RNA-behandling genererer små CRISPR-associerede RNA'er 16 (crRNA'er), der sammen med et transaktiverende crRNA 17 (tracrRNA) samler med effektor Cas9 endonuclease. CrRNA'erne tilvejebringer således specificitet til Cas9-målretning, styring af komplekset til spaltning af komplementære virale DNA-sekvenser og forebyggelse af yderligere infektioner 18 , 19 . Enhver "protospacer" -sekvens i det målrettede DNA kan tjene som kilden til crRNA, så længe den er direkte 5 'til et kort protospacer tilstødende motiv (PAM), NGG i tilfælde af S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. Fraværet af PAM-sekvensen nær afstandsstykket i værtsens CRISPR-locus skelner mellem selv og ikke-selv, hvilket forhindrer målretning af værten. På grund af dets universalitet og fleksibilitet er dette biologiske system blevet kraftigt tilpasset til genomisk redigering, således at næsten ethvert PAM-tilstødende DNA-sted kan målrettes. I denne version smeltede en yderligere modifikation crRNA'et og tracrRNA'et i en enkelt guide RNA (sgRNA) komponent, der blev indlæst i Cas9 proteinet 21 .
Ved ekspression af Cas9 og et sgRNA i eukaryote celler spalter Cas9-proteinet begge DNA-tråde på det målrettede sted. I fravær af en egnet region af homolog sekvens fikserer cellen denne pause via ikke-homolog end-sammenføjning (NHEJ) 22 , 23 , 24 , som typisk introducerer små deletioner eller sjældent insertioner. Når du målretter mod en åbenLæserammen fører reparationen sandsynligvis til en translationsramme, der frembringer et ikke-funktionelt proteinprodukt. I modsætning hertil kan cellen, når den er forsynet med en eksogen template med store områder af homologi, rette dobbeltstrengspausen ved hjælp af homologi-rettet reparation 25 , 26 . Denne rute tillader større præcise deletioner, udskiftninger eller insertioner i genomet, kombineret med indførelsen af excisable markeringsmærker 27 .
Her præsenterer vi protokoller til generering af knockout-cellelinjer ved hjælp af en af disse to CRISPR / Cas9 metoder ( figur 1A ). NHEJ-tilgangen anvender et enkelt sgRNA-cut-site og selektionsafhængig screening, og kræver derfor lidt forudgående forberedelse. Ved brug af denne metode skal guide RNA'er komplementære til exoner nær 5'-enden af transkriptet, som mest sandsynligt frembringer en knockout, skal udformes. Siden modificatIoner til genomet i dette tilfælde er små, screening for knockout-kloner er baseret på prikblots, hvor proteinproduktet vurderes på høj gennemstrømningsmåde. Vi bruger generationen af ELAV-lignende 1 protein (ELAVL1) knockout linjer som et eksempel. Den anden tilgang er baseret på homologi-rettet reparation (HDR) og bruger to sgRNA-cut-sites, der spænder over genet eller regionen af interesse, hvilket tillader sletninger af titusvis af kb. Et plasmid med to regioner af homologi, der flankerer spaltningsstederne, tilvejebringer en erstatningsskabelon ( figur 1B ), der indfører en selekterbar resistensmarkør, som øger effektiviteten af knockout-generationen. Denne metode kan også tilpasses til at indføre genmodifikationer med ordentligt udformede homologi arme. I dette tilfælde muliggør integrationen af et nyt DNA-fragment PCR-baseret screening ( figur 1C ). Her bruger vi generationen af Pumilio RNA bindende familiemedlem 2 (PUM2) knockout linjer som et eksempel.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR / Cas9-systemet har muliggjort effektiv generering af stabile genomiske modifikationer, hvilket giver et mere konsistent alternativ til andre transient manipulationsmetoder. Her har vi præsenteret to metoder til hurtig identifikation af CRISPR / Cas9 gen-knockouts i pattedyrcellelinier. Begge metoder kræver lille cellulært materiale, så test kan ske i tidlige stadier af klonalkultur, hvilket sparer tid og reagenser. For at øge effektiviteten af begge metoder anbefaler vi at teste flere sgRNA'er, da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Gissell Sanchez, Megan Lee og Jason Estep for eksperimentel bistand, og Weifeng Gu og Xuemei Chen til deling af reagenser.
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
