Dette værk beskriver en protokol for chromatinimmunpræcipitation (ChIP) ved anvendelse af en moden mus-T-cellelinie. Denne protokol er egnet til at undersøge fordelingen af specifikke histonmærker på specifikke promotorsteder eller genom-bred.
Signalveje regulerer genekspressionsprogrammer via modulering af chromatinstrukturen på forskellige niveauer, såsom ved post-translationelle modifikationer (PTM'er) af histonehaler, udveksling af canoniske histoner med histonvarianter og nukleosomudsættelse. En sådan regulering kræver bindingen af signal-følsomme transkriptionsfaktorer (TF'er), der rekrutterer chromatinmodificerende enzymer ved regulatoriske elementer defineret som forstærkere. Forståelse af, hvordan signaleringskaskader regulerer enhanceraktivitet kræver en omfattende analyse af bindingen af TF'er, chromatinmodificerende enzymer og beslaglæggelsen af specifikke histonmærker og histon-varianter. Chromatinimmunpræcipitation (ChIP) assays udnytter stærkt specifikke antistoffer til immunpræcipitering af specifikke protein / DNA-komplekser. Den efterfølgende analyse af det oprensede DNA tillader identifikationen den region, der optages af proteinet genkendt af antistoffet. Dette værk beskriver en protokol til effektivt at peRform ChIP af histonproteiner i en moden T-cellelinie af mus. Den præsenterede protokol tillader udførelse af ChIP-analyser inden for en rimelig tidsramme og med høj reproducerbarhed.
Udvikling, differentiering og homeostase afhænger af specifikke genekspressionsprogrammer, der er etableret ved signalering af hændelser, som modulerer chromatinstrukturen og derfor bestemmer, om et specifikt gen aktiveres eller undertrykkes på en celle- og tidsspecifik måde. Under T-celleudvikling skal specifikke genekspressionsprogrammer etableres for korrekt at bestemme modningen af T-celleprecursorer fra den dobbelt-negative (DN) til den enkelt-positive (SP) tilstand, der passerer gennem flere mellemliggende trin 1 . Hvordan genekspressionsprogrammet er dynamisk reguleret under T-celleudvikling er blevet undersøgt bredt i tidligere år af flere laboratorier 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .
Ved post-translationelle modifikationer (PTM) af histoner, udveksling afKanoniske histoner med histon-varianter, nukleosomudkastning og DNA-methylering regulerer ON / OFF-omskifteren af gener. Flere grupper har undersøgt den genombredde fordeling af PTM'er og histonvarianter til bestemmelse af mærker, som er forbundet med forskellige chromatintilstande i både proksimale og distale reguleringsområder 7 , 8 , 9 , 10 . Signalkaskader orkestrerer dynamisk kromatinregulering via udveksling af positive og negative kromatinmodificerende enzymer (også kendt som chromatinmodifikatorer) ved specifikke enhancerelementer. Disse chromatinmodifikatorer regulerer kromatinstrukturen og således transkriptionelle output ved for eksempel dynamisk histon-methylering og acetylering. Dette er tilfældet i Notch-signalvejen 11 , 12 , 13 ,14.
Dynamiske histon PTM'er; Udvekslinger med histon-varianter; Og den dynamiske belægning af histoner, transkriptionsfaktorer og cofaktorer kan undersøges ved chromatinimmunpræcipitation (ChIP) assays. Meget specifikke antistoffer anvendes til oprensning af specifikke DNA-proteinkomplekser, og det oprensede DNA analyseres ved hjælp af kvantitativ PCR (qPCR); Dyb-sekventering (ChIP-Seq); Eller mindre hyppigt i dag hybridisering til microarray (ChIP-ChIP).
ChIP-assays er nogle gange udfordrende på grund af komplikationer med lysis af cellerne, forskydning af chromatin og / eller lav specificitet af antistofferne. Flere strategier er blevet vedtaget for at forbedre protokollen, som det er tilfældet for NEXSON 15 . Anvendelsen af kølevandbad-sonikatorer undgår prøveopvarmning, som kan skade epitoperne, der er til stede på det undersøgte protein, men den energi, der kræves til afskæring af prøverne, dispergeres i vandet.En anden forbedring blev foretaget med udviklingen af fokuserede ultralydningsindretninger, der forhindrer spredningen af energien. Derfor tillader fokuserede ultralydningsindretninger forbedringer i cellelys og chromatinafskæring, hvilket eliminerer operatørinducerede variationer og signifikant øger reproducerbarheden.
Dette arbejde beskriver en protokol (skematisk overblik i figur 1 ) for effektivt at udføre ChIP af histonproteiner i en moden mus T-cellelinie kaldet E2-10HA 16 , 17 . T-celler er sædvanligvis vanskelige at lyse, og afskæringen af deres chromatin har vist sig at være ineffektiv. I denne protokol, der anvender en kølefokuseret ultralydapparat, blev antallet af celler, lysisbufferen og skæringsindstillingen optimeret til E2-10HA-mus-T-cellelinjen. Denne protokol gør det muligt for en at udføre ChIP med høj reproducerbarhed og inden for en rimelig tid. Faktisk kræver detEr ca. to dage for at skære kromatinet og at evaluere skærekvaliteten og tre dage til at udføre immunopræcipitationen, reversere tværbindingen og rense DNA'et.
ChIP er en gyldig teknik til at undersøge, om proteiner eller deres PTM'er beriges ved specifikke genomiske områder. ChIP-analyseresultater er ofte udfordrende at fortolke på grund af biologiske eller tekniske grunde. De biologiske årsager er mangefoldige og omfatter svag eller indirekte binding af proteiner til DNA. Der er også tekniske begrænsninger, såsom begrænset antistofspecificitet og ineffektiv cellelys eller kromatinskæring. En fejlfindingsvejledning ( tabel 5 ) kan hjælpe læseren til at løse de problemer, der kan opstå med ChIP-analyser.
Denne protokol, der gør brug af en kølefokuseret ultralydningsanordning, gør det muligt at skære chromatinet effektivt af en moden T-cellelinie fra mus. Protokollens vigtigste kritiske trin er repræsenteret ved skæring af chromatinet, som altid skal optimeres for hver celletype. Det foreslås at variere antallet af celler og antallet af sonikationscyklusser. Desuden er hun Aring effektivitet er negativt påvirket af tilstedeværelsen af SDS præcipitater i prøverne, som kan danne under lysis af cellerne på is med SDS lysis buffer. I dette tilfælde er det bedst at inkubere prøven efter lysis ved stuetemperatur i nogle få minutter for at reducere forekomsten af SDS-bundfald. Det anbefales at optimere protokollen for at opnå skårede fragmenter mellem 200 og 500 bp og til altid at evaluere skærekvaliteten af prøverne, inden de fortsætter med immunopræcipitationen. Endvidere skal fixeringstiden, mængden af antistof og / eller celler og vaskebetingelserne optimeres for hvert antistof.
Et yderligere kritisk trin i at gøre en ChIP-procedure vellykket er valget af antistoffet, da antistoffer med lav specificitet signifikant reducerer effektiviteten af immunpræcipitationen. Tidligere var en samlet kvalitetsprocedure tilladt til vurdering af specificiteten af flere antistoffer, der var tilgængelige på markedet Ss = "xref"> 19. Screeningsrørledningen var baseret på dot blot, Western blot og ChIP, hvilket gav en liste over reagenser af høj kvalitet, der passer til ChIP 19 . Mere for nylig blev specificiteten af adskillige kommercielt tilgængelige antistoffer evalueret under anvendelse af histonpeptid-mikroarrayplatforme med høj densitet, hvilket muliggør etablering af en database om antistofspecificitet 20 . Læseren kan bruge dette nyttige værktøj til at identificere de mest specifikke antistoffer, som kan anvendes til ChIP-eksperimenter.
Denne protokol er ikke blevet testet for primære T-celler, og i dette tilfælde skal læseren henvise til andre offentliggjorte protokoller, der med succes udfører ChIP på primære T-celler 3 , 4 , 21 . Denne protokol har især været anvendt til at udføre ChIP på en T-cellelinie med mus-stamceller, såvel som på en musendotelcellelinie.
Ove_content "> 5 x 10 6 celler bør anvendes til hver immunpræcipitation til analyse af histon mærker. Fordi denne protokol også kan være egnet med en vis optimering til at udføre ChIP på TF'er eller cofaktorer, er det bedst at øge antallet af celler Anvendt til immunpræcipitationen i disse tilfælde. For at nå det krævede antal celler for hvert forsøg kan flere alikvoter af skæret lysat samles sammen før fortynding af chromatinet i fortyndingsbufferen.Denne protokol kan også ændres til at udføre ChIP på endogene proteiner, der ikke binder direkte til DNA'et. I dette tilfælde kan præfixering med protein-protein tværbindere ( fx dimethyl adipimidat, DMA) være påkrævet (se bilag B for mere information). Den succesfulde udførelse af ChIP på cofactorer blev tidligere udført ved overudtrykning af proteiner, der er fusioneret til et biotin-tag. I dette tilfælde blev proteinet oprenset med streptavidin-conjugaTede magnetiske perler, og en præ-fiksering med DMA blev udført 22 .
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for P. Käse og T. Schmidt-Wöll for fremragende teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af samarbejdsforskningstilskuddet TRR81 og Heisenberg-programmet (BO 1639 / 5-1) fra DFG (German Research Foundation), Max Planck Society og EXC 294 i Freiburg og Excellence Cluster for Cardio Pulmonary System (ECCPS) i Giessen til TB
Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
Phase Lock Gel Heavy 2 ml | 5 Prime | 2302830 | |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |