Dette arbeidet beskriver en protokoll for kromatinimmunutfelling (ChIP) ved hjelp av en moden mus-T-cellelinje. Denne protokollen er egnet til å undersøke fordelingen av spesifikke histonmerker på spesifikke promotorsteder eller genom-bred.
Signalveier regulerer genuttrykksprogrammer ved modulering av kromatinstrukturen på forskjellige nivåer, for eksempel ved post-translasjonelle modifikasjoner (PTM) av histontoner, utveksling av kanoniske histoner med histon-varianter og nukleosomuttakelse. Slike reguleringer krever binding av signal-sensitive transkripsjonsfaktorer (TFs) som rekrutterer kromatinmodifiserende enzymer ved regulatoriske elementer definert som forsterkere. Forstå hvordan signaleringskaskader regulerer forsterkeraktivitet, krever en omfattende analyse av bindingen av TFs, kromatinmodifiserende enzymer og belegget til spesifikke histonmerker og histon-varianter. Kromatinimmunpresipitasjon (ChIP) -analyser benytter svært spesifikke antistoffer for immunpresipitering av spesifikke protein / DNA-komplekser. Den påfølgende analyse av det rensede DNA muliggjør identifikasjon av regionen som okkuperes av proteinet som er anerkjent av antistoffet. Dette arbeidet beskriver en protokoll for å effektivt peRform ChIP av histonproteiner i en moden mus-T-cellelinje. Den presenterte protokollen tillater utførelse av ChIP-analyser i en rimelig tidsramme og med høy reproduserbarhet.
Utvikling, differensiering og homeostase avhenger av spesifikke genuttrykksprogrammer som er etablert ved å signalere hendelser som modulerer kromatinstrukturen og derfor bestemme om et bestemt gen aktiveres eller undertrykkes på en celle- og tids-spesifikk måte. Under T-celleutvikling må spesifikke genuttrykksprogrammer etableres for å bestemme modningen av T-celleprekursorer fra den dobbelte negative (DN) til den enkelt-positive (SP) tilstanden, og passere gjennom flere mellomliggende stadier 1 . Hvordan genuttrykksprogrammet er dynamisk regulert under T-celleutvikling, har blitt utbredt i tidligere år av flere laboratorier 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .
Ved post-translationelle modifikasjoner (PTM) av histoner, utveksling avKanoniske histoner med histon-varianter, nukleosomutkastning og DNA-metylering regulerer PÅ / AV-bryteren av gener. Flere grupper har undersøkt genomspredning av PTM og histonvarianter for å bestemme merker som er forbundet med forskjellige kromatintilstander i både proksimale og distale regulatoriske regioner 7 , 8 , 9 , 10 . Signalkaskader orkestrerer dynamisk kromatinregulering via utveksling av positive og negative kromatinmodifiserende enzymer (også kjent som kromatinmodifikatorer) ved spesifikke forsterkningselementer. Disse kromatinmodifiseringsorganene regulerer kromatinstrukturen og dermed transkripsjonsutgangen ved for eksempel dynamisk histon-metylering og acetylering. Dette er tilfellet i Notch-signalveien 11 , 12 , 13 ,14.
Dynamiske histon PTM; Utveksling med histon-varianter; Og den dynamiske belegget til histoner, transkripsjonsfaktorer og kofaktorer kan undersøkes ved kromatinimmunutfelling (ChIP) -analyser. Helt spesifikke antistoffer brukes til å rense spesifikke DNA-proteinkomplekser, og det rensede DNA analyseres ved kvantitativ PCR (qPCR); Dyp-sekvensering (ChIP-Seq); Eller, mindre ofte i dag, hybridisering til microarray (ChIP-ChIP).
ChIP-analyser er noen ganger utfordrende på grunn av komplikasjoner med cellens lysis, skjæring av kromatinet og / eller lav spesifisitet av antistoffene. Flere strategier har blitt vedtatt for å forbedre protokollen, slik det er tilfelle for NEXSON 15 . Bruk av kjølevann-bad-sonikatorer unngår prøveoppvarming som kan skade epitoperne som er tilstede på proteinet som er undersøkt, men energien som kreves for skjæringen av prøvene blir dispergert i vannet.En annen forbedring ble gjort med utviklingen av fokuserte ultralydapparater som forhindrer spredning av energien. Derfor tillater fokuserte ultralydningsinnretninger forbedringer i cellelyse og kromatinskjæring, eliminerer operatørinducerte variasjoner og øker reproduserbarheten betydelig.
Dette arbeidet beskriver en protokoll (skjematisk oversikt i figur 1 ) for effektivt å utføre ChIP av histonproteiner i en moden mus T-cellelinje kalt E2-10HA 16 , 17 . T-celler er vanligvis vanskelige å lyse, og skjæringen av deres kromatin har blitt påvist å være ineffektiv. I denne protokollen, som bruker en kjølefokusert ultralydapparat, ble antall celler, lysisbufferen og skjæringsinnstillingen optimalisert for E2-10HA-musen T-cellelinjen. Denne protokollen tillater en å utføre ChIP med høy reproduserbarhet og i rimelig tid. Faktisk krever detEr omtrent to dager for å skjære kromatinet og å evaluere kvaliteten på skjæringen og tre dager for å utføre immunutfellingen, reversere tverrbindingen og rense DNA'et.
ChIP er en gyldig teknikk for å undersøke om proteiner eller deres PTM er beriket på bestemte genomiske områder. ChIP-analyseresultater er ofte utfordrende å tolke på grunn av biologiske eller tekniske årsaker. De biologiske årsakene er mangefold og inkluderer svak eller indirekte binding av proteiner til DNA. Det er også tekniske begrensninger, som begrenset antistoff-spesifisitet og ineffektiv cellelys eller kromatinskjæring. En feilsøkingsveiledning ( tabell 5 ) kan hjelpe leseren til å løse problemene som kan oppstå med ChIP-analyser.
Denne protokollen, som benytter seg av en kjølefokusert ultralydapparat, tillater en å effektivt skjære kromatinet av en moden mus-T-cellelinje. Protokollets viktigste kritiske trinn representeres av skjæringen av kromatinet, som alltid må optimaliseres for hver celletype. Det foreslås å variere antall celler og antall sonikasjonssykluser. Videre, hun Aring effektivitet er negativt påvirket av tilstedeværelsen av SDS precipitater i prøvene, som kan danne under lysis av cellene på is med SDS lysis buffer. I dette tilfellet er det best å inkubere prøven etter lys ved romtemperatur i noen minutter for å redusere forekomsten av SDS-utfellingen. Det anbefales å optimalisere protokollen for å oppnå skårte fragmenter mellom 200 og 500 bp og å alltid evaluere skjærekvaliteten av prøvene før de fortsetter med immunutfellingen. I tillegg må fikeringstid, mengde antistoff og / eller celler og vaskebetingelsene optimaliseres for hvert antistoff.
Et mer kritisk skritt i å gjøre en ChIP-prosedyre vellykket er valget av antistoffet, da lav-spesifisitet antistoffer reduserer effektiviteten av immunutfellingen. Tidligere ble en enhetlig kvalitetstestprosedyr tillatt for evaluering av spesifisiteten til flere antistoffer tilgjengelig på markedet Ss = "xref"> 19. Screeningsrøret ble basert på dot blot, Western blot og ChIP, og gir en liste over reagenser av høy kvalitet som passer til ChIP 19 . Mer nylig ble spesifisiteten av flere kommersielt tilgjengelige antistoffer evaluert ved bruk av histonpeptid-mikroarrayplattformer med høy tetthet, hvilket muliggjør etablering av en database på antistoff-spesifisitet 20 . Leseren kan bruke dette nyttige verktøyet til å identifisere de mest spesifikke antistoffene som kan brukes til ChIP-eksperimenter.
Denne protokollen er ikke blitt testet for primære T-celler, og i dette tilfellet bør leseren referere til andre publiserte protokoller som har utført ChIP på primære T-celler 3 , 4 , 21 . Spesielt har denne protokollen blitt vellykket brukt til å utføre ChIP på en T-cellelinje for mus-stamceller, så vel som på en endotelcellelinje.
Ove_content "> 5 x 10 6 celler skal brukes til hver immunutfelling for analyse av histonmerker. Fordi denne protokollen også kan være egnet, med litt optimalisering, for å utføre ChIP på TFs eller kofaktorer, er det best å øke antall celler Brukes til immunutfelling i disse tilfellene. For å nå det nødvendige antall celler for hvert forsøk, kan flere alikvoter av skjæret lysat sammenblandes før fortynning av kromatinet i fortynningsbufferen.Denne protokollen kan også modifiseres for å utføre ChIP på endogene proteiner som ikke binder direkte til DNA. I dette tilfellet kan det forekomme pre-fiksering med protein-protein-tverrbindere ( f.eks. Dimetyladipimidat, DMA) (se vedlegg B for mer informasjon). Den vellykkede ytelsen av ChIP på kofaktorer ble tidligere gjort ved overuttrykning av proteiner som er fusjonert til en biotin-tag. I dette tilfellet ble proteinet renset med streptavidin-conjugaTed magnetiske perler, og en pre-fiksering med DMA ble utført 22 .
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for P. Käse og T. Schmidt-Wöll for utmerket teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av samarbeidsprosjektet TRR81 og Heisenberg-programmet (BO 1639 / 5-1) fra DFG (German Research Foundation), Max Planck Society og EXC 294 i Freiburg, og Excellence Cluster for Cardio Pulmonary System (ECCPS) i Giessen til TB
Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
Phase Lock Gel Heavy 2 ml | 5 Prime | 2302830 | |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |