في الموقع تلطيخ إمونوفلورزنت من البلعمة الذاتية في الخلايا الجذعية العضلات
Summary
ويرتبط البلعمة الذاتية النشطة مع تجديد العضلات المنتجة، وهو أمر ضروري لتنشيط الخلايا الجذعية العضلات (موسك). هنا، ونحن نقدم بروتوكول للكشف في الموقع من LC3، علامة التلقيح الذاتي في ميوس إيجابية موسس من أقسام الأنسجة العضلية من السيطرة والفئران المصابة.
Abstract
زيادة الأدلة على أن البلعمة الذاتية عملية تنظيمية حاسمة للحفاظ على التوازن الأنسجة. ومن المعروف أن البلعمة الذاتية تشارك في تطوير العضلات والهيكل العظمي والتجدد، وقد وصفت عملية البلعمة الذاتية في العديد من الأمراض العضلية واضطرابات العضلات المرتبطة بالعمر. وهناك كتلة وصفت مؤخرا من عملية البلعمة الذاتية التي ترتبط مع استنفاد وظيفي للخلايا الأقمار الصناعية خلال إصلاح العضلات يدعم فكرة أن يقترن النتوء الذاتي النشط مع تجديد العضلات المنتجة. تكشف هذه البيانات عن الدور الحاسم للالتهام الذاتي في تنشيط الخلايا الفضائية خلال تجديد العضلات في كل من الظروف الطبيعية والمرضية، مثل التصنع العضلي. هنا، ونحن نقدم بروتوكول لمراقبة عملية البلعمة الذاتية في حجرة الخلايا الجذعية العضلات (موسك) خلال ظروف التجدد العضلات. يصف هذا البروتوكول منهجية الإعداد لأداء في التصوير المناعي الموقع من LC3، وأوتوفاجي ماركر، و ميود، علامة النسب العضلي، في أقسام الأنسجة العضلية من السيطرة والفئران المصابة. المنهجية ذكرت يسمح لرصد عملية البلعمة الذاتية في حجرة واحدة محددة الخلية، مقصورة موشك، والتي تلعب دورا محوريا في تنظيم تجديد العضلات.
Introduction
تجدد العضلات والهيكل العظمي هو نتيجة للتفاعل بين الخلايا الجذعية للبالغين (خلايا الأقمار الصناعية العضلات، موسس) وأنواع الخلايا الأخرى التي تشارك في عملية التجدد. يتم الحفاظ على التوازن العضلات وظائف من قبل الإشارات مجتمعة الناشئة عن مكانة العضلات والعظة النظامية 1 ، 2 . طوال فترة الحياة، تم الإبلاغ عن التغيرات في وظائف موسك، مكانة العضلات، والإشارات النظامية، مما أدى إلى انخفاض القدرات الوظيفية في كبار السن 3 . يتم تعيين موسس في مكانة تحت الصفيحة القاعدية، وعند إصابة العضلات، يتم تنشيط لإصلاح العضلات التالفة 4 ، 5 . من أجل ضمان استجابة تجديدية منتجة، من الأهمية بمكان أن تنسق مراكز الخدمة المتعددة العمليات المختلفة اللازمة للخروج من السكون، والتجديد الذاتي، ومرحلة التوسع التكاثريمن خلال التمايز العضلي 6 . في المسنين وفي الأمراض المزمنة العضلات، كل هذه الوظائف للخطر، مما يؤدي إلى تغيير وظائف العضلات 2 ، 3 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 .
ماكرووتوفاجي (المشار إليها فيما يلي باسم البلعمة الذاتية) آخذة في الظهور باعتبارها عملية حيوية حاسمة ضرورية للحفاظ على التوازن الأنسجة 14 . عملية التلقيح الذاتي تشمل آليات الاتجار، حيث يتم اجتياح أجزاء من السيتوبلازم، العضيات، والبروتينات في الحويصلات التي تتحلل في نهاية المطاف عن طريق مسار ليسوسوم، وتعزيز إزالة الجزيئات السامة وإعادة تدوير ماكرومولcules. وهذا يوفر مركبات غنية بالطاقة لدعم التكيف مع الخلايا والأنسجة تحت الإجهاد أو الظروف المعاكسة الأخرى 15 ، 16 . جنبا إلى جنب مع نشاطها على البقاء على قيد الحياة الخلية، يمكن أن البلعمة الذاتية تعمل أيضا كمحفز للموت الخلية، اعتمادا على سياق الأنسجة الخلية (على سبيل المثال، طبيعية مقابل الأنسجة السرطانية) ونوع التحفيز الإجهاد 17 ، 18 .
وتشير الأدلة الأخيرة إلى أن البلعمة الذاتية مطلوب للحفاظ على كتلة العضلات وسلامة ميوفيبر 19 و 20 ، وقد أفيد أن ضعاف في مختلف العضلات التصنع 21 ، 22 ، 23 ، بما في ذلك ضمور العضلات دوشين (دمد) 24 ، 25 ، 26 ، 27 </sup> ، 28 ، 29 ، 30. وبالمثل، لوحظ انخفاض تدريجي في عملية البلعمة الذاتية في كبار السن 31 ، 32 ، 33 ، 34 ، 35 ، بعد فقدان كتلة العضلات (المشار إليها ساركوبينيا) 32 ، 33 ، 34 ، 35 ، 36 ، 37 ، وفي بقاء ميوفيبر 38 .
وكان من المتوقع وجود علاقة وثيقة بين البلعمة الذاتية والإمكانات التجددية للعضلات الهيكلية من خلال دراسة من مختبر واغرز، والتي أظهرت أن تقييد السعرات الحرارية يعزز توافر ونشاط موسك 39 . هذا لاوقد أيدت آخر من قبل الملاحظة الأخيرة أن محور Foxo3-نوتش ينشط عملية البلعمة الذاتية أثناء التجديد الذاتي 40 والانتقال موسك من هادئة إلى الدولة المتكاثر 41 . هذه البيانات تتفق مع التخفيض التدريجي للالبلعمة الذاتية من الشباب إلى مسس القديمة وكبار السن، جنبا إلى جنب مع الانخفاض العددي والوظيفي من مراكز الخدمات الطبية خلال الشيخوخة 42 .
في ورقة حديثة، أثبتنا وجود علاقة وثيقة بين البلعمة الذاتية وتجديد العضلات التعويضية التي تميز المراحل المبكرة من تقدم دمد. وبناء على ذلك، لاحظنا تدفق تدفق الذات الذاتي في مراحل لاحقة من تطور المرض، عندما يتم اختراق تجديد العضلات وتليف الأنسجة ترسيب يحدث. ومن المثير للاهتمام، أظهرنا أنه في ظروف التجديد، يتم تنشيط البلعمة الذاتية في موكس، وأن تحوير عملية البلعمة الذاتية يؤثر على تنشيط موسك و فونكتيوناليتي 30 .
وإجمالا، هذه البيانات تسلط الضوء على الحاجة الملحة لاستكشاف عملية البلعمة الذاتية في موكس أثناء تجديد العضلات في الظروف الطبيعية والمرضية وطوال فترة الحياة. هنا، ونحن نقدم بروتوكول لرصد عملية البلعمة الذاتية في موكس في ظروف العضلات التجدد عن طريق أداء المناعية في الموقع لالبروتين المرتبطة 1A / 1B سلسلة الخفيفة 3 (LC3)، علامة من التلقيح الذاتي 43 ، وميود، علامة من في عضلات الأنسجة العضلية من السيطرة والفئران المصابة. المنهجية ذكرت يسمح لرصد عملية البلعمة الذاتية في حجرة واحدة محددة الخلية، و موسك، التي تلعب دورا رئيسيا في تنظيم تجديد العضلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول كيفية مراقبة البلعمة الذاتية في الخلايا الجذعية العضلات والهيكل العظمي خلال تجديد العضلات التعويضية. وقد حاولت عدة أجسام مضادة للتلطيخ المشترك من LC3 و ميود، وتلك التي تعمل في أقسام الأنسجة الماوس وخلق نتائج ناجحة مدرجة هنا (انظر الجدول الم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل نيامز AR064873، مشروع إبيجن ي. P01.001.019 / بروجيتو بانديرا إبيجينوميكا إفت تو ل
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
References
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs?. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
