В этой рукописи описаны методы применения пептидной микрочиповой технологии для профилирования специфичности антител, которые распознают гистоны и их посттрансляционные модификации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ специфичности гистонового антитела с пептидными микрочипами
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пост-трансляционные модификации (ПТМ) на белках гистонов широко изучены для их роли в регулировании структуры хроматина и экспрессии генов. Массовое производство и распределение антител, специфичных к ПТМ гистонов, значительно облегчило исследование этих признаков. Поскольку гистоновые ПТМ-антитела являются ключевыми реагентами для многих применений биохимии хроматина, необходим тщательный анализ специфичности антител для точной интерпретации данных и дальнейшего прогресса в этой области. Этот протокол описывает интегрированный конвейер для проектирования, изготовления и использования пептидных микрочипов для профилирования специфичности гистоновых антител. Аспекты дизайна и анализа этой процедуры облегчаются с помощью ArrayNinja, открытого программного обеспечения и интерактивного программного пакета, который мы недавно разработали для упрощения настройки форматов печати микрочипов. Этот конвейер использовался для скрининга большого количества коммерчески доступного и широко используемого гистонового PTM-антителаS, а данные, полученные в результате этих экспериментов, свободно доступны через онлайн-базу данных Спецификации антител Histone Antibody. Помимо гистонов, общая методика, описанная здесь, может быть широко применена для анализа специфичных к ПТМ антител.
Введение
Геномная ДНК изящно упакована внутри ядра эукариотической клетки с белками гистонов с образованием хроматина. Повторяющейся субъединицей хроматина является нуклеосома, которая состоит из 147 пар оснований ДНК, обернутых вокруг октамерного ядра гистоновых белков - H2A, H2B, H3 и H4 1 . Хроматин широко организован в свободно упакованный эухроматин и плотно упакованные домены гетерохроматинов. Степень уплотнения хроматина регулирует степень, в которой белковые механизмы могут получить доступ к основной ДНК для осуществления фундаментальных процессов, связанных с ДНК, таких как репликация, транскрипция и восстановление.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Установка и запуск ArrayNinja
- Загрузите и установите Oracle Virtual Box с сайта www.virtualbox.org.
- Загрузите и распакуйте виртуальную машину ArrayNinja (VM) с сайта http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
- Откройте Virtual Box и добавьте виртуальную машину ArrayNinja, нажав «Машина», «Добавить» и выберите arrayninja.vbox из папки, в которой была сохранена копия ArrayNinja.
- Запустите ArrayNinja, выбрав его в Virtual Box и нажав зеленую стрелку «начать».
- Виртуальный ящик откроет новое окно и отобразит сообщение о доступе виртуальной машины, перейдя по веб-браузеру на localhost: 2080.60; ПРИМЕЧАНИЕ. Контейнерную ве....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол использовался для разработки и изготовления платформы пептидного микрочипа для анализа специфичности антитела к гистону ПТМ. Массив запрашивает библиотеку из более чем 300 уникальных пептидных объектов (20-40 остатков в длину), представляющих многие известные комбинации ПТМ, обнаруженные на ядрах и вариантах гистоновых белков 38 . Этот конвейер был рабочей лошадкой для скрининга многих широко используемых и коммерчески доступных гистоновых ПТМ-антите.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Надежность антител в приложениях для биомедицинских исследований имеет первостепенное значение 46 , 47 . Это особенно актуально в биохимии хроматина, учитывая положение антител в качестве ключевых инструментов для большинства методов, разработанных для характеристики обилия и распределения гистоновых ПТМ. В представленном здесь протоколе подробно описывается оптимизированный трубопровод для проектирования, изготовления и использования пептидных микрочипов для ан.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана Научно-исследовательским институтом Ван Анделя и грантом исследований Национального института здоровья (CA181343) на SBR
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Печатный буферный | массив | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| стекольный микроскоп со стрептавидиновым покрытием | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| полипропилен 384 луночный планшет | Greiner Bio-one | 784201 | |
| биотин-флуоресцеин | Sigma | 53608 | |
| контактный микрочип принтер | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Принтер с микрочипами |
| контактный микрочип | принтер Генные машины | OmniGrid 100 | OmniGrid Микрочип |
| принтер PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Блокирующий буферный | массивIt | SBB | |
| Гидрофобная восковая ручка | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Гидрофобный барьер PAP Ручка |
| Силикон Прокладка | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Гибридизационный сосуд | Thermo Scientific | 267061 | или аналогичный сосуд |
| Флуоресцентный краситель конъюгированный вторичный антитело | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (против кролика) |
| Флуоресцентный краситель конъюгированное вторичное антитело | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (против мыши) |
| Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Сканер микрочипов | Innopsys | InnoScan 1100AL | или эквивалентный сканер микрочипов |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microchip | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Пептидная матрица | Active Motif | 13001 | |
| Гистоновый код Пептидные микрочипы | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | для воскового импринтера |
| Увлажненный микрочип Слайдовая гибридизационная камера | VWR | 97000-284 | |
| Высокопроизводительный микроскоп Камера для промывки предметных стекол | ArrayIt | HTW | |
| Микроскоп слайдовая центрифуга | VWR | 93000-204 | |
| Антитело 1 | Abcam | 8898 | |
| Антитело 2 | Millipore | 07-473 | |
| Биотинилированный гистоновый пептид | EpiCypher | 12-0001 | Пример пептида. Подобные пептиды с различными модификациями выпускаются из нескольких коммерческих источников. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
Ссылки
- van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Rothbart, S. B., Strahl, B. D.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
