En metode for å lage og levende bilde forskjellige humaniserte bein-margen nisjer i mus er presentert. Basert på den støttende nisje som er opprettet av humane mesenkymceller, induserer tilsetningen av humane endotelceller dannelsen av humane fartøy, mens tilsetningen av rhBMP-2 inducerer dannelsen av humant mus-kimerisk modent benvev.
Humane hematopoietiske stamceller (HSCs) ligger i benmargen (BM) nisje, et intrikat, multifaktorielt nettverk av komponenter som produserer cytokiner, vekstfaktorer og ekstracellulær matrise. HSCs evne til å forbli hvilende, selvfornyelse eller differensiering, og tilegne seg mutasjoner og bli ondartet, avhenger av de komplekse samspillet de etablerer med forskjellige stromale komponenter. For å observere crosstalk mellom humane HSC og den humane BM nisje i fysiologiske og patologiske forhold, utformet vi en protokol for ektopisk modell og bildet en humanisert BM nisje i immunodeficiente mus. Vi viser at bruken av forskjellige cellulære komponenter tillater dannelse av humaniserte strukturer og muligheten til å opprettholde langsiktig human hematopoietisk engraftment. Ved hjelp av tofotonmikroskopi kan vi levebilde disse strukturene på stedet ved enkelcelleoppløsningen, og gi et kraftig nytt verktøy for funksjonell karakterisering av den humane BM mMikromiljø og dets rolle i regulering av normal og ondartet hematopoiesis.
Cell-skjebnebeslutninger som observeres i stamcellefelt er tett regulert av både indre og ekstrinsiske faktorer. Spesielt er det nå allment anerkjent at BM mikromiljøet spiller en grunnleggende rolle i å kontrollere bryteren i HSCs fra en hvilende til en aktiv tilstand, så vel som i deres selvfornyelse eller differensiering skjebne 1 . Videre viser nylige funn at hematologiske maligniteter påvirker funksjonen til BM mikromiljøet, og peker på eksistensen av aktiv krysstal mellom de to rom 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Til tross for de siste fremskrittene, fortsetter mange viktige spørsmål om hvordan aktiviteten til bestemte BM-nisekomponenter bidrar til HSC-adferd og ondartet transformasjon.
BM mikromiljøet er svært heterogent Enous og kompleks blanding av mange forskjellige celletyper, hver med spesialiserte funksjoner. Den rikelige endotel (EC) og vaskulær komponent regulerer næringsinnhold og metabolittomsetning, inngangen og utgangen til forskjellige celler til og fra BM, og flere HSC-funksjoner 7 , 8 . Mesenkymale stromalceller (MSCs), en heterogen populasjon av utifferentierte stamceller og stamceller som er begått gjennom tre forskjellige linjer ( dvs. osteogen, kondrogen, en adipogen), er en annen grunnleggende komponent i BM nisje. Disse MSCene lokaliserer seg både i sentrale områder av BM og i nærheten av endosteal regionen. De kan være forbundet med vaskulære strukturer og er involvert i reguleringen av HSC-funksjon 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,"> 14 , 15 .
Mange rapporter tyder på at HSCs bor i ulike definerte steder i margen, og at deres funksjon kan avhenge av deres presise lokalisering. Det meste av dagens kunnskap om HSCs og deres interaksjon med BM mikromiljøet kommer fra murine studier 1 . Bruken av xenograftmodeller har utvidet denne kunnskapen til humane normale og ondartede HSCs, engrafting i murine BM av immunodeficiente mus 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Selv om dette representerer en gyldig modell, presenterer den fremdeles mange utfordringer, for eksempel behovet for å betinge mottakermusen i de fleste tilfeller for å tillate humant HSC-homing og engraftment eller kryssartsparrieren og den dårlig forstått påvirkning av cellecelleinteraksjoner og funksjoner.
Bruk av nøytraliserende antistoffer og genetisk modifiserte mus, sammen med xenotransplantasjon, har vært medvirkende til å markere den komplekse dialogen som menneskelige HSCs etablerer med sine mikro-miljøer. Introduksjonen og utviklingen av intravital to-foton-konfokalmikroskopi har flyttet disse studiene et skritt fremover, noe som muliggjør direkte, høyoppløselig og dynamisk avbildning av benmarg 19 , 20 , 21 , 22 og gir et kraftig verktøy for funksjonell Karakterisering av BM mikromiljøet og dets rolle i regulering av HSC-funksjonen. For å kringgå noen av problemene som oppstår i klassiske xenotransplantasjonsmodeller, er begrepet engineering en humanisert BM-struktur tatt i forkant. Sammenslåing av biomaterialer og celleimplantasjonskonsepter, rapporter har vist muligheten til å etterligne den menneskelige benmPil mikromiljø i heterotopområder 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Dette åpner muligheten for å bruke bioengineering i musemodeller for å studere human normal og ondartet hematopoiesis 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumorigenese og metastase 40 , 41 , 42 , 43 , 44 .
Basert på tidligere erfaring i beinvevsteknikk og in vivo- bildebehandling 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , beskriver vi en protokoll for bioengineer og levende bildeorganotiske humane BM-vev. Disse strukturene stammer fra implanteringen av humane BM-avledede stromaceller til kollagenbaserte stillaser subkutant podet i immunodeficiente mus. I en tidligere rapport demonstrerte vi at menneskelige MSCer sikrer dannelsen av et humant mikromiljø som er tilstrekkelig for engraftment av humane hematopoietiske celler 45 . Videre beskriver vi hvordan co-implantering av andre humane BM-cellekomponenterS, slik som humane endotelceller (hEC) og / eller cytokiner som er viktige for beindannelse ( f.eks. HBMP2), samarbeide med hMSCs for å generere forskjellige humaniserte mikro-miljøer, som kan bli levende avbildet in situ .
Betydning med hensyn til eksisterende metoder:
I denne protokollen beskrev vi en metode for å generere forskjellige humaniserte mikromiljøer i mus og å visualisere deres arkitektur via tofotonmikroskopi og histologi. De representative dataene som er angitt, viser muligheten for tilnærmingen, ved bruk av forskjellige stromalceller for å konstruere humanisert vev. Protokollen har spesifikke anvendelser til studien av humane hematopoietiske celler og benmargnisjeavledede celler under normale og patologiske forhold. Disse applikasjonene inkluderer studiet av klonal evolusjon, medikamentscreening og krysskala mellom humane HSC og stromale komponenter. I det nye feltet vevsteknikk er det foreslått flere alternative tilnærminger. Tilnærminger til notatet inkluderer utvikling av 3D humaniserte BM strukturer in vitro 55 , 56 , 57 ,S = "xref"> 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 og det ortopotopiske implantatet av humaniserte BM stillaser i mus 64 . Vår tilnærming har fordelen av å kombinere både kompleksiteten til in vivo- systemet med den enkle anatomiske tilgjengeligheten til det humaniserte vevtransplantatet.
Modifikasjoner og feilsøking:
En variasjonskilde i denne protokollen finnes i valget av celler som brukes til å frøstille stillasene. I vårt arbeid brukte vi BM-avledede hMSCs. Imidlertid kan mesenkymceller oppnås fra flere vev, som kan vise karakteristiske egenskaper avhengig av opprinnelsen. Derfor kan bruk av hMSCer avledet fra forskjellige organer vurderes. Imidlertid bør deres evne til å danne bindevev in vivo testes før bruk i denne pRotokoll. Denne protokollen bruker en kommersielt tilgjengelig human endotelcellekilde ( dvs. E4ORF1-transduced HUVEC). Nylig har bruk av organspesifikke endotelceller for forskjellige formål blitt rapportert 65 , 66 . Videre kan bruken av primære hEC som er avledet fra BM, utgjøre en interessant forbedring av protokollen. Derfor kan bruk av forskjellige kilder til endotelceller produsere forskjellige in vivo utfall.
Vi brukte NSG-immunokompromitterte mottakermus for å favorisere implantasjonen av humaniserte stillas og for å unngå vevavvisning. Vi utelukker ikke muligheten for å bruke denne protokollen til å konstruere ektopiske knoglemarvvev i andre musestammer. Faktisk kan rhBMP-2 inducere beindannelse i forskjellige pattedyrsmodeller 47 , 48 , 49 , 50 <sup>, 52 . Imidlertid vil forskjeller i celle-levedyktighet og langsiktig transplantasjon sannsynligvis bli observert ved bruk av forskjellige stammer / modeller.
Tidspunktet for stillasgjenoppretting kan også være fleksibel, avhengig av det endelige formål med eksperimentet. I den presenterte protokollen gjenfinner vi prøver etter 8 – 12 uker etter implantasjon for å vurdere langsiktig hematopoietisk engraftment. For å studere tidlige trinn i den humane BM nisjeformasjonen ( f.eks. Osteokondral vevdannelse 47 eller vaskulær utvikling), kan forskjellige tidspunkter velges.
Live-imaging teknikken vi beskrev i denne protokollen er indikert for kortsiktig bildebehandling av eksplantater. Bruken av et ekvilibrert kammer for å opprettholde fysiologisk temperatur, oksygenspenning og CO 2 -konsentrasjon bør vurderes i tilfeller av langvarig avbildning, for eksempel for å studere motilitetsadferd.
Kritisk StEps i protokollen:
Blant utfordringene knyttet til protokollen vil vi fremheve de tekniske ferdighetene som kreves for noen trinn. Mesenkymale og endotelceller bør brukes ved lavcellepassasjenumre; Ellers vil de ikke kunne støtte humant hematopoietisk celle engraftment in vivo eller delta i de novo vaskulatur og beindannelse in vivo . Vi anbefaler bruk av hMSCs og hECs i passasjer 1 – 5. Stillas forberedelse og cellesedding trinn krever grunnleggende cellekultur ferdigheter og kunnskap om egenskapene til de spesifikke cellene som brukes i prosedyren. Operasjonsprotokollen er ganske enkel, men krever litt øvelse. Vedlikehold av et aseptisk miljø for å unngå forurensning av de implanterte stillasene i immunfektige mus er avgjørende for å sikre eksperimentets suksess. Eksempeleksplanter og levende bildebehandling krever kirurgisk praksis (spesielt for bruk av mikrodrill) og kunnskap omMikroskopsystem. Endelig krever prøvebehandling og histologi grunnleggende kunnskap om teknikkene som skal brukes.
Begrensninger av teknikken:
Tilnærmingen vi beskriver muliggjør visualisering av levende humane hematopoietiske celler som sårer et humanisert beinmargsmiljø, mens menneskelige endotelceller danner vaskulære strukturer og mesenkymceller som danner bein / beinmargeplass. Etter hvert som vevet dannes in vivo , vil den endelige konstruerte stillas fortsatt være kimær (human og murin). Dette problemet bør tas i betraktning, da det kimære vevet ikke fullt ut kan etterligne humant knoglemarvskompleksitet og miljø.
Stillasene som er implantert, har en begrenset størrelse (vi prøvde maksimalt 6,6 x 7,5 x 7 mm), og de kan derfor være vert for et begrenset antall celler for xenotransplantasjon. Det absolutte antall gjenvunnet celler vil også bli begrenset; Dermed skal antallet implanterte stillaseneBeregnes som en funksjon av antall celler som kreves for eksperimentet.
Bildeprogrammet vi beskrev er spesielt nyttig for å observere store områder av levende vev i dyp 150-200 μm fra overflaten uten å forstyrre arkitekturen og skade cellene. Derfor tillater det ikke visualisering av hele stillaset. Hvis en fullstendig skanning av vevet er nødvendig, vil standard immunofluorescens tilnærminger være mer hensiktsmessig.
Fremtidige applikasjoner:
Fremtidens retning for denne bioengineered-modellen ville være å øke kompleksiteten til de humane komponentene i vevet. Kunnskapen og karakteriseringen av den humane BM-nisje har utviklet seg de siste årene 67 , og den beskrevne protokollen kan være en interessant plattform for å studere funksjonen til disse nye cellekomponenter og løselige faktorer, samt deres rolle i å støtte normal / malignAnt HSCs.
Videre gir avbildningsteknikken potensialet for intravital avbildning av stillasene i langsgående studier, noe som vil kreve tekniske forbedringer ved å avdekke stillasene i levende bedøvede mus, med gjenvinning etter kirurgi. Denne tilnærmingen vil kreve ytterligere skritt og er for tiden undersøkt i laboratoriet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker de ansatte i kjernefasilitetene ved Francis Crick Institute (Biologisk forskningsfasilitet, In Vivo Imaging and Experimental Histopathology) og Yolanda Saavedra-Torres og Mercedes Sanchez-Garzon, dyrene hos Crick og LRI, for deres verdifulle hjelp. Vi er takknemlige for Dr. W. Gray for kritisk å lese manuskriptet. DP ble støttet av et ikke-klinisk forskningsmiljø fra EHA. Dette arbeidet ble støttet av The Francis Crick Institute, som mottar kjernefinansiering fra Cancer Research UK (FC001045), UK Medical Research Council (FC001045), og Welcome Trust (FC001045).
Ficoll-Paque | Ge Healthcare | 17-1440-03 | |
Cd34 positive selection Kit | Stemcell | 18056 | Store a 4°C. |
Magnet | Stemcell | 18000 | |
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3 | Bioxcell | BE0001-2 | Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. |
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO) | PeproTech | 200-03, 300-23 and 300-18 | For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100μL of water and mix them. Add 200μL, do alicuots of 45μL and Store at -20°C. |
DMSO | Sigma | D4540 | |
FBS | Life technologies | 10270106 | Heat-inactivate at 56°C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37°C water bath before use. |
MEM-α | Invitrogen | 32571-028 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
Myelocult H5100 | corning | 5100 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
199 | Gibco | 41150-020 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC-FBS, Heat-inactivated | Gibco | 12662-029 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
P/S | Sigma-Aldrich | P0781 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
ECGS | Millipore | 02-102 | Dilute in culture media and use 0.22 mm filter. |
HEPES | Sigma-Aldrich | S1558-50ML | Store at 4°C. |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | Store at 4°C. |
Glutamine | Gibco | 25030 | Store at -20°C. |
Collagen 1 coated cell culture plate | corning | 354505 | |
Trypsin-EDTA solution | Thermo-Fisher | 25200056 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC | Lonza | PT-2501 | Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. |
VeraVec HUVEC endothelial cells | Angiocrine bioscience | hVera101 | |
Human hematopoietic cells | Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. | ||
Gelfoam, Size 12-7mm | Pfizer | 00009-0315-08 | |
PBS | Thermo-Fisher | 10010023 | |
Surgical material | Multiple | Sterile forceps, tweezers and sharp scissors. | |
Sterile tissues | Heat-sterilize paper tissues. | ||
1 ml Syringe with needle of 25G | Terumo | SS+01H25161 | |
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3473 or 3471 | |
BMP2 | Noricum | rhBMP-2 | Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 °C. |
Thrombin | Sigma | T9010 | Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C. |
Fibrinogen | Sigma | F3879 | Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use. |
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm | Falcon | 353001 | |
U-Botton 96 well plate | Falcon | 353077 | |
NSG mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory). |
Chlorhexidine | G9 | Dilute 1:10 before use | |
Carprofen | Pfizer | Rimadyl | 5 mg/g of mouse |
Buprenorphine | Alstoe | Vetergesic | 0.1 mg/g of mouse body weight |
Isoflurane | Abbott | B506 | Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1% |
Trimmer | Wella | Contura HS61 | |
Surgical glue | 3M | Vetbond | |
carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gel | Novartis | Viscotears Liquid Gel | |
Human Normal Immunoglobulin | Gammaplex | 10g vial | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody. |
NT-QTracker | Invitrogen | Q21021MP | Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging. |
AF488-hCD45 | Biolegend | 304017 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
FITC-hCD31 | BD Pharmigen | 555445 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
Super glue | Loctite | Super Glue | |
Micro-Drill Kit | IDEAL – Fisher Scientific | NC9010016 | |
Microsurgical microscope | No specific brand/company is adviced. | ||
LSM 710 NLO | Zeiss | Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used. | |
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation | Spectra-Physics | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32294 | |
Osteosoft | Millipore | 1.01728.1000 | |
Polysine slices | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
Antigen unmasking solution | Vector | H-3300 | Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution. |
Triton 100x | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A96470 | Store at 4 °C. |
Normal Goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | Store at 4 °C. |
Endomucin Antibody | Santa Cruz | sc-65495 | Store at 4 °C. |
hVimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Store at 4 °C. |
hCD31 antibody | DAKO | M0823 | Store at 4 °C. |
hCD45 antibody | DAKO | M0701 | Store at 4 °C. |
ADRP (Perilipin2) | antibodies-online | ABIN283918 | Store at 4 °C. |
Goat anti mouse secondary antibodies | Invitrogen | A11029 or A11005 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rabbit secondary antibodies | Invitrogen | A11037 or A11008 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rat secondary antibodies | Invitrogen | A11007 or A21247 | Store at 4 °C. |
Sudan Black | Sigma | S2380 | Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use. |
DAPI | Sigma | D8417 | Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C. |
Fluorescent mounting media | Dako | S3023 | Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock). |
Cover glass | VWR | 631-0147 |